A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Em pacientes adultos infectados com HIV, a neuroinflamação interfere na sinalização sináptica normal, levando a déficits neurocognitivos que incluem dificuldades de abstração, fluência verbal, aprendizado de atenção, novas informações e memória. O HIV um tat induz a secreção de moléculas inflamatórias, que podem imitar a disfunção sináptica observada em pacientes com HIV aqui. Camundongos adultos que expressam GFP em células mononucleares, incluindo microglia, são usados para investigar a neuroinflamação induzida pelo HIV usando microscopia de crânio fino e dois fótons.

As respostas da microglia após a injeção de tat podem ser visualizadas in vivo. As imagens resultantes demonstram encurtamento e espessamento dos processos microgliais e a formação de estruturas fagocíticas semelhantes a taças, bem como o tráfego periférico de monócitos nos microvasos cerebrais. Olá, sou Dan Marker, do laboratório de Harris Galbard e do Centro de Desenvolvimento Neural e Doenças da Universidade de Rochester.

Olá, sou EF Trombley, do Laboratório de Esca do Departamento de Neurobiologia e Anatomia da Universidade de Rochester. Olá, sou Shain Luu, também do Albas Lab. Hoje mostraremos um procedimento para imagens de dois fótons usando uma preparação de crânio fino.

Usamos esse procedimento para estudar a neuroinflamação crônica. Então, vamos começar no experimento mostrado aqui. OT expressa GFP em linhagens de células mononucleares na incluindo microglia são usados.

Diferentes linhagens de camundongos podem ser usadas para atender às necessidades de um projeto específico. Comece a preparar um camundongo anestesiado com fentanil, midazolam meine para cirurgia. Primeiro, certifique-se de que o animal não responda mais a estímulos dolorosos, como um beliscão na cauda.

Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia pós-anestésica. Em seguida, cubra os olhos do animal com uma pomada oftálmica protetora para mantê-los úmidos. Todos os instrumentos cirúrgicos devem ter sido autoclavados ou esterilizados com um esterilizador de esferas de vidro para desinfetar ainda mais os instrumentos, mergulhando-os em etanol a 70%.

Usando uma tesoura, remova o cabelo do couro cabeludo do animal e desinfete a área com uma solução de iodopovidona a 10% e etanol a 70%. Comece a cirurgia usando uma pequena tesoura para fazer uma incisão na linha média do couro cabeludo, começando de quatro a cinco milímetros, cordal ao crânio e avançando para a frente até a frente dos olhos. Essa incisão deve ser longa o suficiente para que a pele não interfira na colagem da placa que estabiliza a cabeça do camundongo durante a imagem de dois fótons.

Em seguida, aplique 100% de etanol no cotonete estéril para secar as membranas na parte superior do crânio. Raspe-os com uma pinça fina. Se as membranas não forem removidas, a fixação da placa principal ficará instável.

Sob um escopo de dissecação, identifique a área a ser desbastada. Evite áreas de interesse localizadas diretamente sobre as suturas cranianas, pois o crânio é menos estável nessas áreas e os grandes vasos e meninges subjacentes interferirão nas imagens enviadas para a janela de visualização na área de interesse. Então, novamente, usando um cotonete, tente o crânio novamente usando uma solução a 10% de cloreto férrico.

Coloque uma fina camada de ligação permanente, nove 10 cola ao redor das bordas da janela de visualização embaixo da placa principal. Em seguida, coloque a placa sobre a área de interesse no crânio do animal com uma leve pressão para unir a cola. Aplique uma pequena quantidade de acrílico ao redor da borda da janela de visualização usando uma seringa.

Por fim, aplique uma pequena quantidade de Tite 4 54 nas bordas da janela de visualização. Para evitar vazamentos. Aparafuse a placa da cabeça ao suporte do animal e verifique a estabilidade sob um microscópio de dissecção Ao sondar levemente com um par de pinças, não deve haver movimento do crânio em relação à placa da cabeça.

Coloque uma gota de solução salina na janela de visualização para garantir que não haja vazamentos em preparação para o desbaste. Seque o crânio usando uma combinação de cotonetes estéreis e ar comprimido. Afine o crânio usando uma broca IRF 0 0 7 em uma broca micro a duas.

A 4.000 RPM. Muito suavemente, comece a desbastar uma área circular de dois a 2,5 milímetros de diâmetro. Use apenas movimentos leves de varredura quase paralelos ao crânio.

Não use pressão direta para baixo. Pare de perfurar a cada 20 a 30 segundos para remover a poeira óssea usando o ar comprimido. Essas quebras na perfuração permitem que o crânio esfrie para que não haja danos induzidos pelo calor ao tecido cerebral subjacente.

À medida que a perfuração avança, observe a transição para a camada óssea espinhosa mais úmida chamada Diplo. Uma vez atingida essa camada, tenha cuidado extra com a broca. Ocasionalmente, verifique a magreza do crânio colocando solução salina sobre a área fina e visualizando sob o escopo de dissecação.

A solução salina permitirá ainda mais a dissipação de calor. À medida que o crânio é afinado, a vasculatura menor torna-se visível. Use uma microlâmina dentária para obter o afinamento final sob solução salina.

A microlâmina fornece muito mais feedback tátil sobre a estabilidade do crânio. Isso permite preparações muito mais finas do que apenas com a broca. A espessura ideal do crânio para imagens é de 10 a 30 micrômetros.

Todo o processo de desbaste normalmente leva entre 15 e 30 minutos. Verifique a magreza do crânio sob epifluorescência várias vezes enquanto faz uma janela fina do crânio. A nitidez e a profundidade da microglia e vasculatura visíveis dão uma boa indicação de quando a janela está pronta para a imagem.

Quando a janela estiver pronta, use uma pipeta de vidro de um milímetro de diâmetro para colocar uma pequena gota de cola acrílica Cy na área fina do crânio e abaixe cuidadosamente um pedaço de vidro de cobertura sobre ela. Em seguida, pressione suavemente contra o crânio para espremer o excesso de cola, evitando a formação de bolhas entre ele e a lamínula, que pode obstruir a visão. Depois de seco, use uma microlâmina para remover cuidadosamente qualquer cola deixada na parte superior da lamínula em preparação para a imagem de dois fótons.

Cubra a fina janela cortical do crânio com solução salina e localize a área de interesse sob epifluorescência. Para permitir a imagem subsequente da área, tire uma foto usando uma câmera fotográfica para obter imagens. Mostrado aqui é usado um microscópio fotográfico personalizado com um laser de safira ti sintonizado em 920 nanômetros.

A fluorescência é detectada usando um tubo fotomultiplicador ou PMT no modo de detecção de campo completo e um filtro de emissão 5 81 80. Uma lente de imersão em água de 20 x é usada durante toda a sessão de imagem. Defina a saída máxima da potência do laser da objetiva entre 50 e 65 miliwatts.

Em seguida, selecione uma área de interesse na camada cortical um ou dois até 150 micrômetros abaixo da superfície da casca. Para facilitar a recriação de imagens, tire fotos do mesmo campo de visão com zoom digital de um x em dois x e três x. Os vasos sanguíneos podem servir como pontos de referência para encontrar facilmente o mesmo campo de visão durante as sessões de imagem subsequentes.

Sob um zoom de três x, adquira vários Zacks com passos Z de 80 a 90 cada e um passo de 0,69 micrômetro a cada cinco minutos por até 30 minutos. Isso permite uma boa amostragem da morfologia e comportamento microglial ao longo do tempo entre as aquisições de Zacks, verificar o nível de solução salina e a profundidade da anestesia. Se necessário, uma dose de reforço de um terço da dose original do coquetel anestésico pode ser administrada durante o procedimento para evitar a deposição de tat na seringa e na agulha durante a injeção dias antes da injeção.

Siloized o revestimento interno de uma agulha de calibre 35 e seringa de microvolume de 10 microlitros, retirando a solução de colagem até encher a agulha e a seringa. Deixe a solução descansar por cinco minutos à temperatura ambiente, depois esvazie a solução da seringa, remova o êmbolo e deixe a seringa e a agulha secarem completamente. Por fim, lave bem a seringa e a agulha com água deionizada.

Uma vez siloizadas, uma seringa e uma agulha podem ser usadas por mais de seis meses antes que uma recodificação seja necessária. No dia da injeção, coloque uma pequena gota da solução de TAT em uma lâmina de vidro siloizada. Usando uma ponta de pipeta siliconizada, carregue a quantidade desejada de solução na seringa de microvolume a partir desta gota.

Usando uma broca, execute uma pequena craniotomia de 0,5 milímetros de diâmetro, rostral de três milímetros ou lateral à janela cortical fina do crânio, onde duas imagens de fótons foram obtidas. Para conseguir isso, afine cuidadosamente o crânio. Em seguida, use uma pinça afiada para remover a fina camada de osso.

Use um micro manipulador para alinhar a agulha e a seringa de calibre 35 com a craniotomia. Em seguida, avance cuidadosamente a agulha a uma profundidade de 700 a 900 micrômetros abaixo da superfície da casca. Forneça três microlitros a 80 nanolitros por minuto usando uma bomba de seringa controlada por microprocessador.

Esta figura mostra a microglia marcada com GFP visualizada com duas imagens de fótons após a implantação da fina janela cortical do crânio, aproximadamente 50 micrômetros abaixo da superfície da casca. As duas seções únicas de fótons tiradas no dia zero, 15 a 30 minutos após a implantação da fina janela cortical do crânio, bem como aquelas tiradas sete e 17 dias depois, demonstram que as janelas permanecem claras enquanto a micróglia permanece ativada na ausência de insultos inflamatórios. Isso destaca a utilidade desse método para investigar interações normais e inflamatórias entre células efetoras imunes e outros tipos de células neurais.

In vivo, as projeções Z feitas seis e 24 horas após a injeção da neurotoxina do HIV TAT exibem alterações morfológicas acentuadas da microglia ativada. Demonstrando ainda mais nossa capacidade de estudar alterações morfológicas da microglia em tempo real em modelos agudos e crônicos de neuroinflamação. Acabamos de mostrar como preparar uma janela fina do crânio e usá-la para estudar a neuroinflamação ao fazer este procedimento.

É importante lembrar de levar o seu tempo ao cuidar do crânio para evitar qualquer dano causado pela própria preparação. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.