A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Em pacientes adultos infectados com HIV, a neuroinflamação interfere com a sinalização sináptica normal, levando a déficits neurocognitivos que incluem dificuldades com abstração, fluência verbal, atenção, aprendizado, informações novas e memória. O HIV-1 tat induz a secreção de moléculas inflamatórias, que podem imitar a disfunção sináptica observada em pacientes com HIV aqui. Camundongos adultos que expressam GFP em células mononucleares, incluindo micróglias, são utilizados para investigar a neuroinflamação induzida pelo HIV-1 tat utilizando microscopia de dois fótons com crânio fino.

As respostas das micróglias após a injeção de tat podem ser visualizadas in vivo. As imagens resultantes demonstram encurtamento e espessamento dos processos microgliais e a formação de estruturas semelhantes a copos fagocíticos, bem como o tráfego de monócitos periféricos em microvasos cerebrais. Olá, sou Dan Marker do laboratório de Harris Galbard e do Centro de Desenvolvimento Neural e Doença da Universidade de Rochester.

Olá, sou EF Trombley do Laboratório de Esca, do Departamento de Neurobiologia e Anatomia da Universidade de Rochester. Olá, sou Shain Luu, também do Laboratório Albas. Hoje vamos mostrar um procedimento de imagem de dois fótons utilizando uma preparação de crânio fino.

Utilizamos este procedimento para estudar neuroinflamação crônica. Então, vamos começar com o experimento mostrado aqui. OT que expressam GFP em linhagens de células mononucleares, incluindo micróglias, são utilizados.

Pode-se utilizar diferentes linhagens de camundongos para atender às necessidades de um projeto específico. Comece preparando um camundongo anestesiado com fentanil e midazolam para cirurgia. Primeiro, certifique-se de que o animal não responda mais a estímulos dolorosos, como uma preensão na cauda.

Coloque o animal sobre uma placa aquecida para prevenir hipotermia pós-anestesia. Em seguida, cubra os olhos do animal com uma pomada oftálmica protetora para manter os olhos úmidos. Todos os instrumentos cirúrgicos devem ter sido autoclavados ou esterilizados com um esterilizador de contas de vidro; desinfete ainda mais os instrumentos mergulhando-os em etanol 70%.

Usando tesoura, remova os pelos do couro cabeludo do animal, em seguida desinfete a área com uma solução de iodo-povidona a 10% e etanol a 70%. Inicie a cirurgia usando uma tesoura pequena para fazer uma incisão mediana no couro cabeludo, começando quatro a cinco milímetros em direção caudal ao crânio e avançando para frente até a região anterior aos olhos. Essa incisão deve ser longa o suficiente para que a pele não interfira na colagem da placa que estabiliza a cabeça do camundongo durante a imagem de dois fótons.

Em seguida, aplique etanol a 100% no cotonete estéril para secar as membranas na parte superior do crânio. Remova-as utilizando pinças finas. Se as membranas não forem removidas, a fixação da placa craniana será instável.

Sob um microscópio estereoscópico, identifique a área a ser afinada. Evite áreas de interesse localizadas diretamente sobre as suturas cranianas, pois o crânio é menos estável nessas regiões e os vasos sanguíneos e meninges subjacentes interferirão na imagem enviada à janela de visualização da área de interesse. Em seguida, usando um cotonete, teste novamente o crânio com uma solução a 10% de cloreto férrico.

Coloque uma camada fina da cola perma bond, nove 10, ao redor das bordas da janela de visualização sob a placa craniana. Em seguida, posicione a placa sobre a área de interesse no crânio do animal com pressão leve para fixar a cola. Aplique uma pequena quantidade de acrílico ao redor da borda da janela de visualização utilizando uma seringa.

Por fim, aplique uma pequena quantidade de Tite 4 54 nas bordas da janela de visualização para prevenir vazamentos. Parafuse a placa craniana ao suporte do animal e verifique a estabilidade sob um microscópio estereoscópico; ao sondar levemente com uma pinça, não deve haver movimento do crânio em relação à placa craniana.

Coloque uma gota de soro fisiológico na janela de visualização para garantir que não haja vazamentos antes do afinamento. Seque o crânio usando uma combinação de cotonetes estéreis e ar comprimido. Afine o crânio utilizando uma broca IRF 0 0 7 em um microtorno.

A 4.000 RPM. Comece muito suavemente a afinar uma área circular com diâmetro de dois a 2,5 milímetros. Utilize apenas movimentos leves e varredores quase paralelos ao crânio.

Não use pressão direta para baixo. Interrompa a perfuração a cada 20 a 30 segundos para remover o pó ósseo utilizando ar comprimido. Essas pausas na perfuração permitem que o crânio esfrie, evitando danos térmicos ao tecido cerebral subjacente.

À medida que a perfuração avança, observe a transição para a camada óssea espinhosa mais úmida chamada Díploe. Ao atingir essa camada, exerça cautela extra com a broca. Verifique ocasionalmente a finura do crânio colocando soro fisiológico sobre a área fina e observando ao microscópio estereoscópico.

O soro fisiológico permitirá uma dissipação adicional de calor. À medida que o crânio é afinado, vasos menores tornam-se visíveis. Utilize uma microlâmina odontológica para obter o afinamento final sob soro fisiológico.

A microlâmina fornece muito mais feedback tátil sobre a estabilidade do crânio. Isso permite preparações muito mais finas do que com a broca sozinha. A espessura ideal do crânio para imageamento é de 10 a 30 micrômetros.

O processo de adelgaçamento geralmente leva entre 15 e 30 minutos. Verifique a finura do crânio sob fluorescência epiluminescente várias vezes durante a confecção de uma janela craniana fina. A nitidez e a profundidade das microglias e da vasculatura visíveis fornecem uma boa indicação sobre quando a janela está pronta para a aquisição de imagens.

Uma vez que a janela esteja pronta, use uma pipeta de vidro com diâmetro de um milímetro para colocar uma pequena gota de cola acrílica Cy na área do crânio fino e abaixe cuidadosamente um pedaço de lamínula sobre ela. Em seguida, pressione suavemente contra o crânio para expelir qualquer cola em excesso, evitando a formação de bolhas entre ela e a lamínula, o que poderia obstruir a visualização. Após secagem, use uma microlâmina para remover cuidadosamente qualquer cola remanescente sobre a lamínula, em preparação para a imagem de dois fótons.

Cubra a janela cortical do crânio delgado com solução salina e localize a área de interesse sob fluorescência epi. Para permitir a realização de imagens subsequentes da área, tire uma foto utilizando uma câmera fotográfica para imageamento. Aqui é mostrado um microscópio personalizado de duas fotos com um laser de ti safira ajustado a 920 nanômetros.

A fluorescência é detectada utilizando um tubo fotomultiplicador ou PMT no modo de detecção de campo inteiro e um filtro de emissão de 5 81 80. Uma lente de imersão em água de 20 x é utilizada durante toda a sessão de imageamento. Ajuste a saída máxima da potência do laser do objetivo entre 50 e 65 miliwatts.

Em seguida, selecione uma área de interesse, seja na camada cortical um ou dois até 150 micrômetros abaixo da superfície da casca. Para facilitar a reimagem, tire fotos do mesmo campo de visão com zoom digital de um x, dois x e três x. Os vasos sanguíneos podem servir como marcos anatômicos para localizar facilmente o mesmo campo de visão durante sessões subsequentes de aquisição de imagens.

Com uma ampliação de três x, adquira múltiplos Zacks com 80 a 90 etapas Z cada um e um passo de 0,69 micrômetro a cada cinco minutos, durante até 30 minutos. Isso permite uma boa amostragem da morfologia e do comportamento dos micróglios ao longo do tempo entre as aquisições de Zacks; verifique o nível de salina e a profundidade da anestesia. Se necessário, uma dose de reforço de um terço da dose original do coquetel anestésico pode ser administrada durante o procedimento para prevenir a deposição de tat na seringa e na agulha durante os dias anteriores à injeção.

Silicone o revestimento interno de uma agulha de calibre 35 e de uma seringa de volume micro de 10 microlitros, puxando a solução de calibragem até preencher tanto a agulha quanto a seringa. Deixe a solução repousar por cinco minutos à temperatura ambiente, depois esvazie a solução da seringa, remova o êmbolo e deixe a seringa e a agulha secarem completamente. Por fim, lave bem a seringa e a agulha com água desionizada.

Uma vez silanizado, uma seringa e agulha podem ser usados por mais de seis meses antes que uma nova silanização seja necessária. No dia da injeção, coloque uma pequena gota da solução de TAT sobre uma lâmina de vidro silanizada. Usando uma ponteira de pipeta silanizada, carregue a quantidade desejada de solução na seringa de volume micro a partir dessa gota.

Usando uma broca, realize uma pequena craniotomia com diâmetro de 0,5 milímetros, três milímetros à frente ou laterais à janela cortical de osso fino onde foram obtidas imagens de dois fótons. Para isso, afine cuidadosamente o crânio. Em seguida, use uma pinça afiada para remover a fina camada óssea.

Use um micro manipulador para alinhar a agulha calibrada de 35 e a seringa com a craniotomia. Em seguida, avance cuidadosamente a agulha até uma profundidade de 700 a 900 micrômetros abaixo da superfície da lâmina. Administre três microlitros a uma taxa de 80 nanolitros por minuto utilizando uma bomba de seringa controlada por microprocessador.

Esta figura mostra micróglia marcada com GFP visualizada por imagem de dois fótons após o implante da janela cortical de crânio fino, aproximadamente 50 micrômetros abaixo da superfície da lâmina. As únicas secções de dois fótons obtidas no dia zero, de 15 a 30 minutos após o implante da janela cortical de crânio fino, bem como aquelas obtidas sete e 17 dias depois, demonstram que as janelas permanecem claras enquanto a micróglia continua ativada na ausência de agressões inflamatórias. Isso destaca a utilidade deste método para investigar tanto as interações normais quanto inflamatórias entre células efetoras imunes e outros tipos celulares neurais.

In vivo, as projeções Z obtidas seis e 24 horas após a injeção da neurotoxina do HIV, TAT, exibem alterações morfológicas acentuadas de micróglias ativadas. Isso demonstra ainda mais nossa capacidade de estudar alterações morfológicas da micrógia em tempo real em modelos agudos e crônicos de neuroinflamação. Acabamos de mostrar como preparar uma janela de crânio fino e utilizá-la para estudar neuroinflamação ao realizar este procedimento.

É importante lembrar de ter calma ao manipular o crânio para evitar danos causados pelo próprio preparo. Assim sendo, é isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.