Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Este procedimento utiliza imagem de células vivas para visualizar a transferência de HIV marcado com GFP através de sinapses virológicas entre células T CAT jerk que expressam HIV e células T primárias não infectadas. O ensaio de transferência célula a célula começa com a transfeção de células T CAT jerk com HIV gag IG FP, um clone fluorescente infeccioso do HIV tipo um; as células CAT jerk transfectadas que expressam HIV gag. IG FP são então misturadas com células T primárias não infectadas marcadas com C-M-T-M-R e carregadas em uma câmara de imagem, onde a transferência de HIV marcado com GFP através da sinapse virológica pode ser observada.

Os dados resultantes são analisados usando software de análise de imagem para revelar os detalhes da transferência do HIV através das sinapses virológicas de células T. Olá, meu nome é Benjamin Dale do laboratório de Ben Chen do Departamento de Medicina da Escola de Medicina Mount Sinai. Meu nome é Greg McNerney do laboratório do Dr. Thomas Huser no Centro NSF de Biopotonica no Centro Médico da uc Davis.

E eu sou Deanna Thompson, também do laboratório do Dr. Thomas Huser. Hoje vamos mostrar um procedimento para visualizar a transferência célula a célula do HIV-1 utilizando microscopia confocal em tempo real. Neste procedimento, células Jurkat são transfectadas com um clone molecular infeccioso do HIV, apenas pessoal de laboratório treinado trabalhando em instalações de biossegurança certificadas.

Células de cultura de tecidos de nível dois mais ou de nível de biossegurança três podem realizar o protocolo aqui apresentado. O trabalho com HIV infeccioso em instalações de imagem deve ser aprovado pelo escritório local de biossegurança institucional. Mantenha as células de gato sacudido a serem usadas como células doadoras em uma concentração entre dois vezes 10 à quinta e oito vezes 10 à quinta células por mililitro.

Na cultura de células jerk cat, uma concentração celular superior a oito vezes 10 à quinta células por mililitro resulta em uma redução na eficiência de transdução. Para iniciar o procedimento, transfecte cinco vezes 10 à sexta células jerk cat com o plasmídeo viral HIV gag IGFP utilizando o método de nucleofecção amax conforme descrito no protocolo escrito anexo, e deixe as células recuperarem durante a noite. Os linfócitos mononucleares do sangue periférico são purificados a partir de capas buffy de sangue humano total por centrifugação em gradiente de densidade FICO.

Os linfócitos T CD4 positivos primários são purificados a partir de células mononucleares do sangue periférico por seleção negativa utilizando um kit de isolamento de células T CD4 positivas. As células T CD4 positivas selecionadas negativamente são coletadas a partir de uma coluna magnética e cultivadas em nosso meio PMI com 10% de FPS suplementado com 10 unidades por mililitro de IL-2 recombinante humana. Também é possível alíquotar os linfócitos T CD4 positivos primários isolados e congelá-los com o auxílio de recipientes criogênicos para congelamento. Os recipientes são colocados em um congelador a -70 graus Celsius por um mínimo de três a quatro horas.

As células são então transferidas para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Agora que as células jerk head foram transfectadas e as células T primárias-alvo CD4 positivas foram isoladas, prossiga com a limpeza e marcação das células no dia seguinte à transfeção. As células jerk estão agora expressando o construto fluorescente infeccioso de HIV.

Ao manipular amostras infecciosas, usamos um jaleco de laboratório com fechamento frontal e duas luvas. Remova os detritos celulares das células transfectadas por centrifugação em meio de alta densidade fial high pack. Primeiro, distribua 1,5 mililitros de fial pack no fundo de um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, sobreponha suavemente o material em gradiente com as células transfetadas jerk hat em um volume de cinco mililitros do meio PMI. Neste momento, as células transfetadas jerk hat são capazes de produzir HIV infeccioso. Portanto, todas as ponteiras de pipeta que entrarem em contato com as células que expressam HIV devem ser desinfetadas com solução de hipoclorito a 10%.

Antes de descartar em um recipiente dentro da cabine de segurança biológica, tampe o tubo e pulverize a parte externa do tubo com uma solução de etanol 70%, depois enxugue com um lenço seco descartável. Centrifugue as células a 400 Gs durante 20 minutos à temperatura ambiente com a frenagem desativada. Após a centrifugação, utilize uma pipeta para remover cuidadosamente as células da interface com o meio e transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Dilua as células com o meio RPMI até um volume total de 15 mililitros e centrifugue a 300 Gs por 10 minutos.

À temperatura ambiente, suspendemos o pellet em três mililitros de meio de cultura jerk hat e transferimos para um poço de dois centímetros de uma placa de seis poços. Coloque a placa no incubador de cultura de tecidos até o momento de utilizá-la no dia seguinte. Na noite do mesmo dia, rotule as células T primárias CD4 positivas utilizadas como células-alvo para distingui-las das células doadoras. Primeiro, pelletize quatro vezes 10 das seis células T primárias CD4 positivas por meio de centrifugação a 400 Gs durante 10 minutos.

Em seguida, lave as células com cinco mililitros de PBS e ressuspenda em dois mililitros de PBS, adicionando cell tracker orange até uma concentração final de 1,5 micromolar e incube a 37 graus Celsius por minutos. Quando as células terminarem a incubação, adicione oito mililitros de meio completo chica e centrifugue a 400 Gs por 10 minutos.

Re-suspenda as células em três mililitros de meio completo suplementado com 10 unidades por mililitro de IL-2 e coloque no incubador de cultura de tecidos durante a noite. Após a incubação noturna, as células doadoras e as células-alvo estão prontas para o experimento de transferência célula a célula. Antes de montar o experimento de transferência célula a célula, prepare a câmara de imagem para amortecer a plataforma contra flutuações de temperatura no ambiente.

E, para bloquear a luz ambiente, um grande anteparo preto é colocado sobre todo o conjunto do microscópio aquecido, criando uma câmara de ar isolada ao redor do sistema. A câmara de imagem é mantida a uma temperatura estável de 37 graus Celsius usando um aquecedor termostático com uma ponta de termopar do tipo T posicionada ao lado da amostra para realimentação de temperatura. Pré-aqueça por 30 minutos antes de montar a amostra.

A imagem confocal com disco giratório utilizando um microscópio óptico invertido é usada para criar imagens confocais tridimensionais da transferência de HIV de célula para célula. Todos os componentes de hardware e aquisição, incluindo um estágio Z, são controlados pelo software MetaMorph ou MetaMorph IQ versão 1.8. A varredura é realizada por uma unidade confocal de disco giratório CSU-10, que utiliza simultaneamente mais de 800 pontos confocais para aumentar drasticamente a velocidade de varredura, complementando sua rapidez. A unidade CSU-10 é combinada com uma câmera altamente sensível do tipo dispositivo de acoplamento de carga com multiplicação eletrônica, permitindo a aquisição rápida de imagens em condições de pouca luz, o que reduz tanto o fotodesbotamento quanto a fototoxicidade.

A fonte de luz de fluorescência é um laser a gás iônico de argônio criptônio com múltiplos comprimentos de onda. Um filtro óptico sintonizável And or Oko ou A OTF é utilizado para selecionar os comprimentos de onda desejados, que aqui são 488 nanômetros e 568 nanômetros, controlando ao mesmo tempo sua potência para reduzir ainda mais o fotodesbotamento e prolongar o tempo de imageamento. O A OTF bloqueia rapidamente o laser após cada exposição de 15 a 30 milissegundos, quando a câmera não está adquirindo imagens, evitando exposições desnecessárias enquanto as imagens são transferidas da câmera E-M-C-C-D para o computador.

A luz laser é incorporada ao sistema de disco giratório utilizando um espelho dicróico de quatro bandas (405, 488, 568, 647). A emissão fluorescente é separada por comprimento de onda utilizando um espelho dicróico long-pass de 560 nanômetros com um divisor de imagem. O canal verde é filtrado usando um filtro passa-banda de 525/50 nanômetros e o canal vermelho é filtrado usando um filtro passa-banda de 609/54 nanômetros. Os dois canais são projetados lado a lado na câmera E-M-C-C-D.

Enquanto a câmara de imagem está aquecendo, prepare as células para o experimento de transferência célula a célula. Use um hemocitômetro para contar as células ette que expressam HIV gag IGFP. Coloque o hemocitômetro em uma placa de Petri para evitar a exposição direta às células que expressam o vírus.

Lave as células com meio independente de dióxido de carbono e re-suspenda em meio para imagem de células vivas numa concentração de um a três vezes 10 elevado a sete células por mililitro. O uso de meio independente de dióxido de carbono elimina a necessidade de uma câmara ambiental com dióxido de carbono. Para a aquisição de imagens.

As células também contam, lavam e ressuspendem os linfócitos T primários marcados CD4 positivos conforme mostrado anteriormente para as células dur hat. Em seguida, inicie a transferência célula a célula misturando 20 microlitros de células dur hat transfectadas com HIV gag IGFP com 40 microlitros de linfócitos T primários marcados CD4 positivos e carregue 50 microlitros em uma câmara microscópica de EBD tratada para cultura de tecidos e permeável a gases. Sobre a câmara com tampões e fixe os tampões envolvendo a interface da câmara plug EBIT D com parafina.

Limpe a câmara de imagem com um lenço químico umedecido com etanol 70% e deixe secar ao ar brevemente na capela. Transporte a câmara de imagem selada dentro de um recipiente fechado para evitar exposição acidental. Caso a câmara caia durante o transporte logo após o carregamento da câmara de imagem IBD com células, monte o dispositivo no microscópio.

Adquira imagens de pares de células utilizando um objetivo de imersão a óleo de 60 x 1,42 NA, pois a alta abertura numérica melhora significativamente a resolução, maximizando a velocidade de aquisição por pilhas de imagens 3D. Reduza a região de gravação da câmera do EM CD à área imediata de um par de células. Além disso, um grande passo Z entre 0,45 e 0,75 micrômetros também pode ajudar a acelerar a aquisição nessas condições.

As imagens são registradas continuamente em intervalos de 20 a 60 minutos. A aquisição de imagens repetidas do mesmo ponto da amostra pode se estender por até seis horas com fotoesbranquecimento mínimo. Cada segmento de dados é composto por dezenas de milhares de imagens que podem ocupar um total de cinco a 20 gigabytes.

Para facilitar o transporte e a análise dos arquivos grandes, cada arquivo é dividido e exportado como segmentos de arquivo de imagem TIFF de um gigabyte. Para analisar as imagens adquiridas, utilize qualquer um dos diversos programas de software de análise de imagens. Consulte o protocolo escrito acompanhante para obter detalhes sobre a análise de imagens, incluindo correção de desbotamento de intensidade e rastreamento automático e manual de pontos de gag.

Em 10 a 15 minutos após a mistura, pode-se visualizar células de gato expressando IGFP de HIV gag aderindo a células T primárias positivas para CD4 por meio de imagem. Esses conjugados permitem avaliar os movimentos de pontos de gag em células infectadas, bem como em células-alvo. Após a sinapse, em 30 minutos a três horas, pode-se observar o movimento de pontos de gag IGFP para dentro das células-alvo marcadas com rastreador celular.

Acabamos de mostrar como visualizar a transferência de célula para célula do HIV entre linfócitos T. Ao realizar esses procedimentos, é muito importante lembrar-se de observar todas as precauções de nível de biossegurança dois mais ou de nível de biossegurança três ao manipular amostras que foram expostas a células expressando HIV. Lembre-se também de usar células JCA bem mantidas e DNA livre de endotoxinas para otimizar a transfeção.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.