Name: Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Aprenda a visualizar a transferência de HIV entre células T usando microscopia confocal ao vivo com clones fluorescentes. Este método permite analisar a dinâmica da transmissão viral através de sinapses virológicas em tempo real.

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Esta revisão foi apoiado pelo National Institutes of concede Saúde, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, prémios de carreira Hirschl Scientist para BKC e pelo Centro de NSF para Biophotonics Ciência e Tecnologia, Acordo de Cooperação PHY012099, e uma Saúde UCD Prêmio de Pesquisa do Sistema para TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Ciência 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Visão global Célula a célula-propagação do HIV foi originalmente descrita utilizando células Jurkat infectadas pelo HIV como células do doador e CD4 + primárias linfócitos T como células aceitador 1,2,3. Nestes estudos, o vírus foi detectado em células fixas usando coloração de anticorpos. Para acompanhar a transferência do vírus de célula a célula em células vivas, nós explorar um recombinante, clone infeccioso molecular do HIV chamado HIV Gag-iGFP 4. Ele carrega a proteína verde fluorescente (GFP) inserida internamente na proteína da mordaça entre os domínios MA e CA. Este clone molecular do HIV mantém infectividade sem a necessidade de vírus auxiliares. Partículas do vírus a partir desta clone são estequiometricamente carregado com proteína fluorescente verde, proporcionando um forte sinal de fluorescência para monitorar a montagem viral e transferência entre as células. Quando usado em conjunto com inertes de células-tracking corantes fluorescentes, pilhas destinatário pode ser discriminado a partir de células de doadores de entrada, e permitindo que se visualize a transferência de HIV de uma célula T infectada para uma célula T não infectados 5. Formação de sinapses virológica e transferência de vírus de uma célula para outra pode ser observada em células vivas, enquanto eles são cultivadas em um selado, câmara de imagem gás-permeáveis. (Dia 1) 2. Preparação de HIV Gag iGFP-Transfectados Células T Jurkat <ol><li> Prepare o CD4 humano + das células T linha Jurkat (ATCC, Manassas, VA) cuidado com a manutenção das células em uma concentração entre 2 x x 10 5 e 8 10 5 células / mL em Jurkat meios de cultura (RPMI 1640, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / mL de penicilina, estreptomicina e 100 mg / mL). Chave para o sucesso: Cultura de células Jurkat em concentrações acima de 8 x 10 5 células / mL irá resultar em uma redução na eficiência de transfecção. Nota: A transfecção de DNA HIV Gag iGFP-proviral em células T, como descrito abaixo, resulta na produção de uma replicação competente vírus da imunodeficiência humana. Como tal, todos os procedimentos que devem ser realizadas apenas por pessoal treinado em laboratório certificado nível de biossegurança 2 + ou salas de cultura de biossegurança nível 3 (BL2 + / BL3) tecido. Trabalhar com HIV infecciosas em instalações de imagem deve ser aprovado por seu escritório de biossegurança institucional local. </li><li> Transfecção do Jurkats com o plasmídeo viral, HIV Gag iGFP usando o método nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 células por centrifugação por 10 min a 150 x g. Aspirar o sobrenadante e lavar as células de fosfato estéril salina tamponada (PBS). Centrifugar as células e ressuspender o sedimento a 97 mL do pré-aquecido V solução, nucleofector contendo suplemento do fabricante. Adicione três mL de endotoxina livre da mordaça iGFP HIV-plasmídeo (1 mg / mL) à suspensão de células e misture delicadamente. Transferir a suspensão de célula para uma cuvete e nucleofect usando o programa S-18. Transferir imediatamente as células a 3 mL de mídia Jurkat pré-aquecido a cultura sem antibióticos. </li><li> Para preparar CD4 + células-alvo para as sinapses virológica, obtemos células mononucleares do sangue periférico de buffy casacos usando um protocolo de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) padrão. Células T CD4 + são, então, negativamente selecionado usando um kit de isolamento magnético talão (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Estes podem ser criogenicamente armazenados em N2 líquido, em alíquotas de 5 x 10 6 cells/500 mL de meios de congelamento (90% de soro fetal bovino DMSO serum/10%). Descongeladas CD4 + células T primárias são cultivadas em RPMI 10% FBS, suplementado com 10 unidades / mL de IL-2. </li></ol> (Dia 2) 3. Recuperação de células vivas a partir Jurkats Transfectados com HIV Gag iGFP e coloração das células-alvo com corantes fluorescentes <ol><li> Permitir que as células Jurkat para se recuperar da transfecção durante a noite. Em seguida, retire os detritos celulares por centrifugação em um gradiente de Ficoll Hypaque material de densidade. Dispense 1,5 mL de Ficoll-Paque para o fundo de um tubo de 15 mL cônico. Delicadamente sobrepor este material com o gradiente Jurkats transfectadas em um volume de 5 mL de RPMI. Centrifugar as células a 400 xg por 20 min à temperatura ambiente com o freio. Remova cuidadosamente as células a partir da interface media / Ficoll usando uma pipeta. Transferi-los para um novo tubo de 15 mL cônico. Diluir as células com RMPI para um volume total de 15 mL e centrifugar a 300 xg por 10 min. Ressuspender o sedimento em 3 mL de meios de cultura em um Jurkat dois centímetros bem (6 bem-placa) e as células voltem ao tecido da cultura incubadora. </li><li> Para diferenciar as células-alvo a partir de células de doadores em experimentos de transferência de célula-célula que prelabel as células CD4 + alvo com corantes fluorescentes. CD4 + primárias células T são rotulados do mesmoing antes de usar. Tivemos excelente sucesso células T rotulagem com as duas CellTracker e corantes CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Enquanto a concentração de corantes e tempos de incubação deve ser otimizada, dependendo do corante especial e com o tipo, um protocolo de representante segue. Pellet 4 x 10 6 CD4 + primárias células T, girando a 400 xg por 10 min. Lavar as células com 5 mL de PBS e ressuspender em 2 mL de PBS. Adicionar CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) para uma concentração final de 1,5 mM e incubar a 37 ° C por 20 min. Adicionar 8 mL de mídia Jurkat completa e centrifugar a 400 xg por 10 min. Ressuspender as células em 3 mL de meio completo suplementado com 10 unidades / mL de IL-2 e coloque na cultura de tecidos incubadora durante a noite. </li></ol> (Dia 3) 4. Monitoramento de transferência de célula para célula de HIV Gag iGFP usando imagens de células vivas Nós usam rotineiramente HIV Gag iGFP células Jurkat transfectadas 48 horas após a transfecção. No entanto, temos utilizado com sucesso células nas primeiras 24 horas, e tão tarde quanto 72 horas pós-transfecção. <ol><li> Aproximadamente 48 horas após a transfecção, HIV Gag iGFP-Jurkats expressar são contados, lavado com CO 2 de mídia independente (Invitrogen, Carlsbad, CA), e ressuspenso em células vivas mídia de imagem (CO 2 de mídia independente, 10% de soro fetal bovino, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina e 100 mg / ml, 10 unidades / mL IL-2) em uma concentração de 1-3 x 10 7 células / mL. </li><li> Em uma forma similar, lavar e ressuspender rotulados CD4 + primárias células T com uma concentração de 1-3 x 10 7 células / mL nos meios de comunicação de imagens de células vivas. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP transfectadas com CD4 Jurkats principal + células T na proporção 1:2 ou 1:3 e de carga em uma cultura de tecidos tratados, gás permeável, MicroChamber (Ibidi, Verona, WI). Por exemplo, misturar 20 mL de HIV Gag iGFP-Jurkats transfectadas com 40 mL de rotulados CD4 + células T primárias. Carga de 50 mL desta mistura em uma câmara de Ibidi e selar a câmara com plugs. Segura as velas envolvendo a ficha / Ibidi interface de câmara com parafilme. </li></ol> 5. Considerações para as plataformas de microscopia: spinning disco de imagem confocal Depois de carregar uma câmara de imagem Ibidi com células, nós imediatamente montar o dispositivo em um microscópio invertido óptico (Olympus iX71, Center Valley, PA). A câmara de Ibidi devem ser transferidos para o microscópio apenas por BL2 + pessoal treinado laboratório usa roupas de segurança adequadas. Apesar de viver de células de imagem comumente utiliza câmaras de incubação caro para manter um ambiente estável a 37 ° C, esta foi realizada por meio de um aquecedor simples e econômica termostática (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA), juntamente com uma ponta termopar tipo T montada ao lado a amostra para o gabarito temperatura adequada. Temos encontrado usando CO 2-mídia independente nos permite manter a viabilidade celular de alta, evitando o uso de uma câmara de CO 2. Para atenuar a plataforma contra flutuações de temperatura na sala e para bloquear a luz ambiente de fundo, um preto grande sudário é drapejado sobre a configuração do microscópio / aquecedor de toda a criação de um bolsão de ar com isolamento em torno do sistema. Isso reduz bastante variação de temperatura e deriva de exemplo associado relacionadas com a temperatura, mas exige pré-aquecimento por 30 minutos antes da montagem da amostra. 6. Processamento de Dados Transferência de Aquisição e Imagem As imagens são tiradas com um 60x 1,42 NA objetivo de imersão em óleo (UPlanApo N, Olympus) como a alta abertura numérica (NA) melhora muito a resolução. Para criar imagens 3D confocal, a verificação é realizada por uma unidade de disco giratório confocal (CSU-10, Yokagawa, Japão) que, simultaneamente, usa&gt; 800 pontos confocal para aumentar drasticamente a taxa de varredura. Para complementar a sua velocidade, o CSU-10 é emparelhado com um altamente sensível elétron-multiplicando dispositivo carregado de acoplamento (EMCCD, ixon + 897, Andor Technologies, Irlanda) da câmera para permitir rápida, de imagens com pouca luz, que reduz a fotodegradação e fototoxicidade. A fonte de luz de fluorescência é um multi-comprimento de onda ARKR ion de gás laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), onde o comprimento de onda desejado (488 nm) e potência do laser medido logo antes da objetiva do microscópio (&lt;1 mW) são selecionados por um acústico- óptico sintonizável filtro (AOTF), (Andor Technologies). Para reduzir ainda mais fotobranqueamento e prolongar o tempo de imagem total, o AOTF rapidamente (microssegundos) desliga o feixe de laser cada vez que a câmera está inativo (10-20 ms) enquanto a imagem recém-adquirido é entregue a partir do CCD (15-30 exposição ms) para o computador. A luz laser é acoplado no sistema de disco giratório com um quad-band 405/488/568/647 dichroic espelho (Semrock, Rochester, NY). Emissão de fluorescência é filtrada usando um filtro passa-banda 525 / 50 (Semrock) dentro de uma roda de filtros (Ludl Produtos eletrônicos, Hawthorne, NY) montado bntre a câmera EMCCD ea unidade de disco confocal girando. Todo o hardware e aquisições, incluindo um z-stage (Mad City Labs, Madison, WI), são controlados pelo iQ Andor v1.8 software. Para maximizar a velocidade de aquisição em torno de 1,2-1,9 segundo pilhas de imagens 3D, de culturas na região de gravação de câmera de baixo para EMCCD área imediata da célula par de. Além disso, à custa de algumas informações em z, um grande passo z entre 0,45-0,75 M pode ser usada para acelerar a aquisição. Imagem sob essas condições pode durar até seis horas - utilizando segmentos minutos contínuos 20-60 - com fotobranqueamento mínimo. Ao todo, cada segmento de dados ocupa tipicamente 50-20 Gb de espaço como dezenas de milhares de imagens são tomadas. Para facilitar o transporte e análise dos arquivos de dados de grande porte, cada conjunto de aquisição precisa ser quebrado e exportada como TIFF segmentos 1 Gb de arquivos de imagem usando o Andor iQ v1.8 software. A partir daqui, muitos pacotes de software excelentes estão disponíveis para análise de imagem, tais como Metamorph, Volocity e ImageJ (recomendamos sua variação Fiji). Quando dois marcadores fluorescentes devem ser controladas, nós gravar simultaneamente os dois sem abrandar a aquisição através de um &quot;modo de ecrã dividido.&quot; Ambos os marcadores está animado por duas linhas diferentes de laser ARKR menos uma vez (muitas vezes 488 e 568 nm). Inserido diretamente diante da câmera EMCCD é uma imagem de divisão (OptoSplit II, Cairn, Kent, Reino Unido) que separa as duas imagens diferentes. Cada imagem é, então, independentemente filtrada usando filtros de fluorescência (Semrock) e projetados lado a lado da câmera ao mesmo tempo criando o &quot;split-screen&quot; efeito. Este seria, então requerem corte manual e alinhamento das imagens mais tarde, em processamento de imagem. 7. Considerações para Processamento de Imagem e Análise de Dados Nós normalmente executam análise de imagem com Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) em computadores Macintosh (Apple, Inc). Spinning disco laser de imagens de microscopia confocal são primeiramente ajustados em sua intensidade para corrigir fotobranqueamento, então deconvolved com Volocity. Medições de intensidade e acompanhamento de puncta Gag é realizada com o módulo de Quantificação Volocity. Para conjuntos de imagens onde o movimento relativo a uma sinapse pré-formado precisa ser calculado, um algoritmo de monitoramento automatizado é empregado que monitora o botão sináptico durante toda a seqüência. Inspeção manual das regiões de interesse definidas pelo software autotracking devem ser realizados para confirmar que o software tem rastreado corretamente o objeto desejado. Para objetos onde o contraste com os objetos no ambiente é muito fraco, rastreamento manual pode ser feita numa base de quadro-a-quadro. O pacote de software Volocity permite a exportação de XYZ localização, volume e sinal integrado os objetos desejados. A distância entre a sinapse e velocidade do objeto rastreado são calculados através da normalização do movimento para o centro do botão sináptico. 8. Resultados representante Dentro de 10 a 15 minutos de mistura deve ser capaz de visualizar HIV Gag iGFP células Jurkat expressar aderir a CD4 + células T primárias. Imagem destes conjugados, pode-se avaliar os movimentos de puncta mordaça nas células infectadas, bem como em células-alvo após synaspe. Pode-se observar o movimento da mordaça iGFP-puncta em células-alvo logo após sinapses são formadas.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos aqui um método simples para visualizar a transmissão de HIV de célula-célula. Uma pesquisa recente de nosso laboratório e outros sugere que este pode ser o modo predominante de transmissão do HIV entre as células T. O método descrito aqui utiliza uma forma recombinante do HIV, chamado HIV-Gag iGFP, que carrega um geneticamente codificado tag proteína verde fluorescente no estruturais da mordaça proteína do núcleo,. Por causa dos níveis elevados de GFP produzidos em cada partícula do vírus, este clone replicação competente do HIV permite aos pesquisadores para rastrear partículas de vírus individuais em tempo real. Este vírus devem ser especialmente útil em estudos sobre a transferência de montagem e célula-célula de HIV. A transferência de HIV por célula-célula de transferência é altamente eficiente. Durante uma hora, três co-cultura, de rotina, vemos vírus transferido para 20-30% de células primárias de T, avaliado por citometria de fluxo. Eficiências semelhantes são qualitativamente visto durante imagens de células vivas. Infectadas por vírus de células T começam sinapses formando com células primárias de T não infectadas, quase imediatamente após o início da co-cultura. Interessante, nem todas as células T primárias são capazes de interagir com as células infectadas pelo HIV Jurkat apesar interações forçadas com laser pinças (observações não publicadas, GM). HIV-Gag iGFP será sem dúvida útil para determinar subpopulações de células T que são mais suscetíveis a célula-transferência, tanto in vitro como in vivo.

<table><tbody><tr><td>Células T Jurkat</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camada leucocitária de sangue total</td><td>Centro de Sangue de Nova York</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Nucleofector e Solução V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kits EndoFree Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo HIV Gag-iGFP</td><td>Laboratório Chen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de células T CD4+</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corantes Celltracker/CellTrace</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio independente de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de imagem</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus IX-71</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de óleo PlanApo N 1.42NA 60X</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser de íons gás ArKr Innova 70C</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidade confocal de disco giratório tipo Nipkow CSU-10</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dicroico divisor de feixe Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 525/50</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera eletrônica amplificada por acoplamento de carga iXon+ 897</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor termostático ASI 400</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando transferência de células-célula de hiv usando clones fluorescente de hiv e microscopia confocal ao vivo

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Fundindo a proteína verde fluorescente para suas proteínas favorito, os biólogos têm agora a possibilidade de estudar vivos complexos processos celulares através de microscopia de fluorescência de vídeo. Para acompanhar os movimentos da proteína do núcleo do vírus da imunodeficiência humana durante a transmissão célula a célula do vírus da imunodeficiência humana, temos GFP-tagged a proteína Gag no contexto de um clone infeccioso molecular do HIV, chamado HIV-Gag iGFP. Estudamos esse clone viral por microscopia confocal de vídeo. No experimento seguinte visualizadas, nós transfectar uma linhagem de células T humanas com HIV Gag iGFP, e nós usamos fluorescente etiquetado CD4 + não infectadas as células T para servir como células-alvo para o vírus. Usando o rótulos diferentes fluorescentes podemos facilmente seguir a produção viral e transporte através de estruturas chamadas sinapses intercelular virológica. Simples câmaras de gás permeável imagens nos permitem observar sinapses com microscopia confocal viver de minutos a dias. Estas abordagens podem ser usadas para rastrear as proteínas virais como eles se movem na de uma célula para outra.

Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Ao fundir a proteína fluorescente verde às suas proteínas de interesse, os biólogos agora têm a capacidade de estudar processos celulares complexos em organismos vivos utilizando...

Este procedimento utiliza imagem de células vivas para visualizar a transferência de HIV marcado com GFP através de sinapses virológicas entre células T CAT jerk que expressam HIV e células T primárias não infectadas. O ensaio de transferência célula a célula começa com a transfeção de células T CAT jerk com HIV gag IG FP, um clone fluorescente infeccioso do HIV tipo um; as células CAT jerk transfectadas que expressam HIV gag IG FP são então misturadas com células T primárias não infectadas marcadas com C-M-T-M-R e carregadas em uma câmara de imagem, onde a transferência de HIV marcado com GFP através da sinapse virológica pode ser observada.Os dados resultantes são analisados usando software de análise de imagens para revelar os detalhes da transferência do HIV através das sinapses virológicas de células T. Olá, meu nome é Benjamin Dale do laboratório de Ben Chen do Departamento de Medicina da Escola de Medicina Mount Sinai. Meu nome é Greg McNerney do laboratório do Dr. Thomas Huser no Centro NSF de Biopotonica no Centro Médico da UC Davis.E eu sou Deanna Thompson, também do laboratório do Dr. Thomas Huser. Hoje vamos mostrar um procedimento para visualizar a transferência célula a célula do HIV-1 utilizando microscopia confocal em tempo real. Neste procedimento, células Jurkat são transfectadas com um clone molecular infeccioso do HIV, apenas pessoal de laboratório treinado trabalhando em instalações certificadas de biossegurança.Cômodos de cultura de tecidos de nível dois mais ou de nível de biossegurança três podem realizar o protocolo aqui apresentado. O trabalho com HIV infeccioso em instalações de imagem deve ser aprovado pelo escritório local de biossegurança institucional. Mantenha as células de gato jerk a serem usadas como células doadoras em uma concentração entre dois vezes 10 à quinta e oito vezes 10 à quinta células por mililitro.Na cultura de células de gato jerk, uma concentração celular superior a oito vezes 10 à quinta células por mililitro resulta em uma redução na eficiência de transdução. Para iniciar o procedimento, transfecte cinco vezes 10 à sexta potência de células de gato jerk com o plasmídeo viral HIV gag IGFP utilizando o método de nucleofecção amax conforme descrito no protocolo escrito acompanhante, permitindo que as células recuperem durante a noite. Células mononucleares do sangue periférico são purificadas a partir de capas leucocitárias de sangue humano total por centrifugação em gradiente de densidade FICO.Os linfócitos T CD4 positivos primários são purificados a partir de células mononucleares do sangue periférico por seleção negativa utilizando um kit de isolamento de células T CD4 positivas. As células T CD4 positivas selecionadas negativamente são coletadas a partir de uma coluna magnética e cultivadas em nosso meio PMI com 10% de FPS suplementado com 10 unidades por mililitro de IL-2 recombinante humana. Também é possível alíquotar os linfócitos T CD4 positivos primários isolados e congelá-los com o auxílio de recipientes criogênicos para congelamento. Os recipientes são colocados em um congelador a -70 graus Celsius por um mínimo de três a quatro horas.As células são então transferidas para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Agora que as células jerk head foram transfectadas e as células T primárias alvo CD4 positivas foram isoladas, prossiga com a limpeza e marcação das células no dia seguinte à transfeção. As células jerk estão agora expressando o construto fluorescente infeccioso de HIV.Ao manipular amostras infecciosas, usamos um jaleco de laboratório com fechamento frontal e duas pares de luvas. Remova os detritos celulares das células transfectadas por centrifugação em um meio de alta densidade fial high pack. Primeiro, distribua 1,5 mililitros de fial pack no fundo de um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, sobreponha suavemente o material em gradiente com as células transfetadas do chapéu jerk em um volume de cinco mililitros do meio PMI. Neste ponto, as células transfetadas do chapéu jerk são capazes de produzir HIV infeccioso. Portanto, todas as ponteiras de pipeta que entrarem em contato com as células que expressam HIV devem ser desinfetadas com solução de hipoclorito a 10%.Antes de descartar em um recipiente dentro da cabine de segurança biológica, tampe o tubo e pulverize a parte externa do tubo com uma solução de etanol 70%, depois enxugue com um lenço seco descartável. Centrifugue as células a 400 Gs durante 20 minutos à temperatura ambiente com a frenagem desativada. Após a centrifugação, utilize uma pipeta para remover cuidadosamente as células da interface com o meio e transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Dilua as células com o meio RPMI até um volume total de 15 mililitros e centrifugue a 300 Gs por 10 minutos.À temperatura ambiente, suspendemos o pellet em três mililitros de meio de cultura jerk hat e transferimos para um poço de dois centímetros de uma placa de seis poços. Coloque a placa no incubador de cultura de tecidos até o momento de utilizá-la no dia seguinte. Na noite do mesmo dia, rotule as células T primárias CD4 positivas utilizadas como células-alvo para distingui-las das células doadoras. Primeiro, pelletize quatro vezes 10 das seis células T primárias CD4 positivas por meio de centrifugação a 400 Gs durante 10 minutos.Em seguida, lave as células com cinco mililitros de PBS e ressuspenda em dois mililitros de PBS, adicionando o corante celular laranja até uma concentração final de 1,5 micromolar e incube a 37 graus Celsius por minutos. Quando as células terminarem a incubação, adicione oito mililitros de meio completo Chica e centrifugue a 400 ×g por 10 minutos.Re-suspenda as células em três mililitros de meio completo suplementado com 10 unidades por mililitro de IL-2 e coloque no incubador de cultura de tecidos durante a noite. Após a incubação noturna, as células doadoras e as células-alvo estão prontas para o experimento de transferência célula a célula. Antes de montar o experimento de transferência célula a célula, prepare a câmara de imagem para amortecer a plataforma contra flutuações de temperatura no ambiente.E, para bloquear a luz ambiente de fundo, um grande anteparo preto é colocado sobre todo o conjunto do microscópio aquecido, criando uma bolsa de ar isolada ao redor do sistema. A câmara de imagem é mantida a uma temperatura estável de 37 graus Celsius usando um aquecedor termostático com uma ponta de termopar do tipo T posicionada ao lado da amostra para realimentação de temperatura. Pré-aqueça por 30 minutos antes de montar a amostra.A imagem confocal com disco giratório utilizando um microscópio óptico invertido é usada para criar imagens confocais tridimensionais da transferência de HIV de célula a célula. Todos os componentes de hardware e aquisição, incluindo um estágio Z, são controlados pelo software Andor IQ versão 1.8. A varredura é realizada por uma unidade confocal de disco giratório CSU10, que utiliza simultaneamente mais de 800 pontos confocais para aumentar drasticamente a taxa de varredura, complementando assim sua velocidade. A CSU10 é combinada com uma câmera altamente sensível do tipo dispositivo de carga acoplada com multiplicação eletrônica, permitindo a aquisição rápida em condições de pouca luz, o que reduz tanto o fotodesbotamento quanto a fototoxicidade.A fonte de luz de fluorescência é um laser a gás iônico de argônio criptônio multicomprimento de onda. Um filtro óptico sintonizável And or Oko ou A OTF é utilizado para selecionar os comprimentos de onda desejados, que aqui são 488 nanômetros e 568 nanômetros, ao mesmo tempo em que controla sua potência para reduzir ainda mais o fotodesvanecimento e prolongar o tempo de imageamento. O A OTF bloqueia rapidamente o laser após cada exposição de 15 a 30 milissegundos, quando a câmera não está adquirindo imagens, evitando exposições desnecessárias enquanto as imagens são transferidas da câmera E-M-C-C-D para o computador.A luz laser é incorporada ao sistema de disco giratório utilizando um espelho dicróico de quatro bandas 405/488/568/647. A emissão fluorescente é separada por comprimento de onda usando um espelho dicróico longpass de 560 nanômetros com um divisor de imagem. O canal verde é filtrado usando um filtro passa-banda de 525/50 nanômetros e o canal vermelho é filtrado usando um filtro passa-banda de 609/54 nanômetros. Os dois canais são projetados lado a lado na câmera E-M-C-C-D.Enquanto a câmara de imagem está aquecendo, prepare as células para o experimento de transferência célula a célula. Use um hemocitômetro para contar as células ette que expressam HIV gag IGFP. Coloque o hemocitômetro em uma placa de Petri para evitar a exposição direta às células que expressam o vírus.Lave as células com meio independente de dióxido de carbono e re-suspenda em meio para imagem de células vivas na concentração de um a três vezes 10 elevado a sete células por mililitro. O uso de meio independente de dióxido de carbono elimina a necessidade de uma câmara ambiental com dióxido de carbono. Para a aquisição de imagens.As células também contam, lavam e ressuspendem os linfócitos T primários marcados CD4 positivos conforme mostrado anteriormente para as células dur hat. Em seguida, inicie a transferência célula a célula misturando 20 microlitros de células dur hat transfectadas com HIV gag IGFP com 40 microlitros de linfócitos T primários marcados CD4 positivos e carregue 50 microlitros em uma câmara microscópica de EBD tratada para cultura de tecidos e permeável a gases. Selle a câmara com tampões e fixe os tampões envolvendo a interface da câmara plug EBIT D com parafina.Limpe a câmara de imagem com um lenço químico umedecido com etanol 70% e deixe secar ao ar brevemente na capela. Transporte a câmara de imagem selada dentro de um recipiente fechado para evitar exposição acidental. Caso a câmara caia durante o transporte logo após o carregamento da câmara de imagem IBD com células, monte o dispositivo no microscópio.Adquira imagens de pares de células utilizando um objetivo de imersão a óleo de 60 x 1,42 NA, pois a alta abertura numérica melhora significativamente a resolução, maximizando a velocidade de aquisição por pilhas de imagens 3D. Reduza a região de gravação da câmera do EM CD à área imediata de um par de células. Além disso, um grande passo Z entre 0,45 e 0,75 micrômetros também pode ajudar a acelerar a aquisição nessas condições.As imagens são gravadas continuamente em intervalos de 20 a 60 minutos. A aquisição repetida de imagens do mesmo ponto da amostra pode se estender por até seis horas com fotoesbranquecimento mínimo. Cada segmento de dados é composto por dezenas de milhares de imagens que podem ocupar um total de cinco a 20 gigabytes.Para facilitar o transporte e a análise dos arquivos grandes, cada arquivo é dividido e exportado como segmentos de arquivo de imagem TIFF de um gigabyte. Para analisar as imagens adquiridas, utilize qualquer um dos diversos programas de software de análise de imagens. Consulte o protocolo escrito acompanhante para obter detalhes sobre a análise de imagens, incluindo correção de desbotamento de intensidade e rastreamento automático e manual de pontos de gag.Em 10 a 15 minutos após a mistura, pode-se visualizar células de gato expressando IGFP de HIV gag aderindo a células T primárias positivas para CD4 por meio de imagem. Esses conjugados permitem avaliar os movimentos de pontos de gag nas células infectadas, bem como nas células-alvo. Após a sinapse, em 30 minutos a três horas, pode-se observar o movimento de pontos de gag IGFP para dentro das células-alvo marcadas com rastreador celular.Acabamos de mostrar como visualizar a transferência de célula para célula do HIV entre linfócitos T. Ao realizar estes procedimentos, é muito importante lembrar-se de observar todas as precauções de nível de biossegurança dois mais ou de nível de biossegurança três ao manipular amostras que foram expostas a células que expressam HIV. Lembre-se também de utilizar células JCA bem mantidas e DNA livre de endotoxinas para otimizar a transfeção.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

Nós desenvolvemos um vetor lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsivo, o elemento Rev-resposta (RRE), que pode regular a expressão do gene repórter de uma forma HIV-1 Tat e Rev-dependente. O vetor permite a detecção específica de HIV replicar em células vivas através da expressão da GFP.

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Fonte: Shah, R., et al. Imagem de Fluorescência Multiplexada em Célula Única para Visualizar Ácidos Nucléicos e Proteínas Virais e Monitorar Infecções por HIV, HTLV, HBV, HCV, Vírus Zika e Influenza. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a visualização simultânea de DNA, RNA e proteína do capsídeo do HIV-1 em linfócitos humanos infectados, utilizando hibridização de DNA ramificado e imunofluorescência, permitindo a análise detalhada das etapas da replicação viral em células individuais.

Imagens de Fluorescência Multiplexadas de Ácidos Nucleicos Virais e Proteínas em Linfócitos Humanos Infectados

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Imagem de infecções por vírus alphaherpes células vivas permite a análise dos eventos dinâmicos de transporte e dirigido propagação intercelular. Apresentamos aqui as metodologias que utilizam estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes para facilitar a visualização dos conjuntos virais durante a infecção de neurónios primários.

De células vivas de Alphaherpes Vírus Transporte anterógrada e Spread

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Aqui, apresentamos um protocolo no qual células únicas são monitoradas para eventos agudos e infecção produtiva pelo HIV-1 em um dispositivo nanofluido. Os dados de imagem definem interações entre receptores de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Este é o primeiro método para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade para estudar a cinética e as interações moleculares.

Caracterização unicelular de influxo de cálcio e infecção pelo HIV-1 usando uma plataforma optofluidica multiparmétrica

Aprenda a visualizar a transferência de HIV entre células T usando microscopia confocal ao vivo com clones fluorescentes. Este método permite analisar a dinâmica da transmissão viral através de sinapses virológicas em tempo real.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

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