Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Este procedimento usa imagens de células vivas para visualizar a transferência de HIV marcado com GFP através de sinapses virológicas entre células T CAT que expressam HIV e células T primárias não infectadas. O ensaio de transferência de célula para célula começa com a transecção de células T CAT jerk com HIV gag IG FP, um clone fluorescente infeccioso do HIV, as células transfectadas jerk cat expressando HIV gag. IG FP são então misturados com células T primárias não infectadas marcadas com CMMR e carregadas em uma câmara de imagem onde a transferência de HIV marcado com GFP através da sinapse virológica pode ser observada.

Os dados resultantes são analisados usando software de análise de imagem para revelar os detalhes da transferência do HIV através das sinapses virológicas de células T. Olá, meu nome é Benjamin Dale, do laboratório de Ben Chen no Departamento de Medicina da Escola de Medicina Mount Sinai. Meu nome é Greg McNerney no laboratório do Dr. Thomas Huser no NSF Center for Biophotonics no UC Davis Medical Center.

E eu sou Deanna Thompson, também do laboratório do Dr. Thomas Huser. Hoje mostraremos um procedimento para visualizar a transferência de células celulares do HIV usando microscopia confocal ao vivo. Neste procedimento, as células jerk hat são transfectadas com um clone molecular infeccioso do HIV apenas pessoal de laboratório treinado trabalhando em biossegurança certificada.

As salas de cultura de tecidos de nível dois mais ou três de nível de biossegurança podem realizar o protocolo mostrado aqui. Trabalhar com HIV infeccioso em instalações de imagem deve ser aprovado pelo escritório de biossegurança institucional local. Mantenha as células do gato jerk para serem usadas como células doadoras em uma concentração entre duas vezes 10 para a quinta e oito vezes 10 para a quinta células por mililitro.

Na cultura de gatos jerk, a concentração de células médias superior a oito vezes 10 elevado à quinta células por mililitro resulta em uma redução na eficiência trans. Para iniciar o procedimento, transfecte cinco vezes 10 para as seis células do gato com o plasmídeo viral, HIV gag IGFP Usando o método de afeto do núcleo amax, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha, permita que as células se recuperem durante a noite. As células mononucleares do sangue periférico são purificadas a partir de camadas leucocitárias de sangue humano total por centrifugação com gradiente de densidade FICO.

As células T CD quatro positivas primárias são purificadas das células mononucleares do sangue periférico por seleção negativa usando um kit de isolamento de quatro células T positivas para CD. As células T positivas CD quatro selecionadas negativamente são coletadas de uma coluna magnética e cultivadas em nosso PMI com 10% FPS que é complementado com 10 unidades por mililitro de IL humano recombinante dois também se pode alíquota do CD primário isolado quatro células T positivas e congelá-las com o auxílio de recipientes de congelamento criogênico. Os recipientes de congelamento são colocados em um freezer de 70 graus Celsius negativos por um período mínimo de três a quatro horas.

As células são então transferidas para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Agora que as células da cabeça do jerk são transfectadas e o CD primário alvo quatro células T positivas são isoladas, prossiga para a limpeza e rotulagem das células no dia seguinte à transfecção. As células jerk agora estão expressando a construção infecciosa fluorescente do HIV.

Ao manusear amostras infecciosas, usamos um jaleco de fechamento frontal e dois pares de luvas. Remover os restos celulares das células transfectadas por centrifugação sobre um meio de alta densidade de embalagem. Primeiro, dispense 1,5 mililitros de embalagem de fial no fundo de um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, sobreponha suavemente o material gradiente com as células de chapéu transfectadas em um volume de cinco mililitros de nosso meio PMI. Neste ponto, as células transfectadas são capazes de produzir HIV infeccioso. Portanto, todas as pontas de pipeta que entram em contato com as células que expressam o HIV devem ser desinfetadas com solução de água sanitária a 10%.

Antes de descartar em um recipiente dentro do gabinete de biossegurança, tampe o tubo e borrife a parte externa do tubo com uma solução de etanol a 70% e limpe com um lenço seco e centrifugue as células a 400 Gs por 20 minutos em temperatura ambiente com a quebra. Após centrifugação, use uma pipeta para remover cuidadosamente as células da interface do meio e transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Dilua as células com nosso meio PMI até um volume total de 15 mililitros e centrifugue a 300 GS por 10 minutos.

À temperatura ambiente, suspendemos o pellet em três mililitros de meios de cultura jerk hat e transferimos para um poço de dois centímetros de uma placa de seis poços. Coloque a placa na incubadora de cultura de tecidos até que esteja pronta para uso no dia seguinte. Na noite do mesmo dia, rotular o CD primário com quatro células T positivas usadas como células-alvo, a fim de distingui-las das células doadoras: Primeiro projétil quatro vezes 10 dos seis CDs primários, quatro células T positivas, girando a 400 Gs por 10 minutos.

Em seguida, lave as células com cinco mililitros de PBS e Resus. Suspenda em dois mililitros de PBS, adicione o rastreador de células laranja a uma concentração final de 1,5 micromolar e incube a 37 graus Celsius por minutos. Quando as células terminarem de incubar, adicione oito mililitros de meio chica completo e centrifugue a 400 Gs por 10 minutos.

Ressuspenda as células em três mililitros de meio completo suplementado com 10 unidades por mililitro de IL dois e coloque na incubadora de cultura de tecidos durante a noite. Após a incubação durante a noite, o doador e as células-alvo estão prontos para o experimento de transferência de célula para célula. Antes de configurar o experimento de transferência de célula para célula, prepare a câmara de imagem para proteger a plataforma contra flutuações de temperatura na sala.

E para bloquear a luz da sala de fundo, uma grande cobertura preta é colocada sobre toda a configuração de calor do microscópio, criando uma bolsa de ar isolada ao redor do sistema. A câmara de imagem é mantida a 37 graus Celsius estáveis usando um aquecedor termostático com uma ponta de termopar tipo T colocada ao lado da amostra para feedback de temperatura. Pré-aqueça por 30 minutos antes de montar a amostra.

A imagem confocal de disco giratório com um microscópio óptico invertido é usada para criar imagens confocais 3D da transferência de célula para célula do HIV. Todo o hardware e aquisição, incluindo um estágio Z, são controlados pelo software e ou IQ versão 1.8 A varredura é realizada por uma unidade confocal de disco giratório CS U 10 que usa simultaneamente mais de 800 pontos confocais para aumentar drasticamente a taxa de varredura para complementar sua velocidade. O CS U 10 é emparelhado com uma câmera de dispositivo acoplado carbonizado de multiplicação de elétrons altamente sensível para permitir imagens rápidas com pouca luz, o que reduz o fotobranqueamento e a fototoxicidade.

A fonte de luz de fluorescência é um laser de gás de íon de argônio criptônio de vários comprimentos de onda. Um filtro óptico sintonizável e ou Oko ou um OTF é usado para selecionar os comprimentos de onda desejados, que são 488 nanômetros e 568 nanômetros aqui, controlando seu poder para reduzir ainda mais o fotobranqueamento e estender o tempo de imagem. O A OTF fecha rapidamente o laser após cada exposição de 15 a 30 milissegundos quando a câmera não está adquirindo imagens, evitando exposição desnecessária enquanto as imagens são transferidas da câmera EMCD para o computador.

A luz laser é incorporada ao sistema de disco giratório usando um espelho dicróico de banda quádrupla 4 0 5 4 88 5 68 6 47 A emissão fluorescente é separada por comprimento de onda usando um espelho diic de 560 nanômetros de comprimento com um divisor de imagem. O canal verde é filtrado usando um filtro passa-banda de 525 sobre 50 nanômetros e o canal vermelho é filtrado usando um filtro passa-banda de 609 sobre 54 nanômetros. Os dois canais são projetados lado a lado na câmera EMCD.

Enquanto a câmara de imagem está aquecendo, prepare as células para o experimento de transferência de célula para célula. Use um hemocitômetro para contar as células Et que expressam HIV gag IGFP. Coloque o hemocitômetro em uma placa de Petri para evitar a exposição direta às células que expressam o vírus.

Lave as células com dióxido de carbono, meios independentes e ressuspenda em meios de imagem de células vivas a uma concentração de uma a três vezes 10 das sete células por mililitro. O uso de meios independentes de dióxido de carbono elimina a necessidade de uma câmara ambiental de dióxido de carbono. Para imagens.

As células também contam, lavam e ressuspendem as quatro células T positivas do CD primário marcado, como mostrado para as células do chapéu. Em seguida, inicie a transferência de célula para célula, misture 20 microlitros de células transfectadas com 40 microlitros de células T positivas CD primárias marcadas e carregue 50 microlitros em uma cultura de tecidos tratada com gás permeável. A microcâmara EBD sela a câmara com plugues e prenda os plugues envolvendo a interface da câmara EBIT D do plugue com a paraforma.

Limpe a câmara de imagem com um pano químico casado com etanol 70% e deixe-o secar ao ar brevemente no capô. Transporte a câmara de imagem selada em um recipiente lacrado para evitar exposição acidental. Se a câmara cair em trânsito imediatamente após carregar a câmara de imagem IBD com células, monte o dispositivo no microscópio.

Tire imagens de pares de células usando uma objetiva de imersão em óleo de 60 x 1,42 NA, pois a alta abertura numérica melhora muito a resolução para maximizar a velocidade de aquisição por pilhas de imagens 3D. Corte a região de gravação da câmera do EM CD até a área imediata de um par de células. Além disso, um grande passo Z entre 0,45 e 0,75 micrômetros também pode ajudar a acelerar a aquisição nessas condições.

As imagens são gravadas continuamente em intervalos de 20 a 60 minutos. A imagem repetida do mesmo ponto de amostra pode se estender por até seis horas com o mínimo de fotobranqueamento quando adquirida. Cada segmento de dados é composto por dezenas de milhares de imagens que podem ocupar um total de cinco a 20 gigabytes.

Para facilitar o transporte e a análise dos arquivos grandes, cada arquivo é dividido e exportado como segmentos de arquivo de imagem TIFF de um gigabyte. Para analisar as imagens adquiridas, use qualquer um dos vários programas de software de análise de imagem. Consulte o protocolo escrito que acompanha para obter detalhes sobre a análise da imagem, incluindo correção de branqueamento de intensidade e rastreamento automático e manual de pontos de mordaça.

Dentro de 10 a 15 minutos após a mistura, pode-se visualizar o HIV gag IGFP expressando células de gato jerk aderindo à imagem primária de quatro células T positivas para CD. Nesses conjugados, pode-se avaliar os movimentos dos pontos de gag em células infectadas, bem como em células-alvo. Após a sinapse, dentro de 30 minutos a três horas, pode-se observar o movimento dos pontos gag IG FP nas células-alvo que são marcadas com rastreador de células.

Acabamos de mostrar como visualizar a transferência de célula para célula do HIV entre células T. Ao fazer esses procedimentos, é muito importante lembrar de observar todas as precauções de nível de biossegurança dois mais ou três ao manusear amostras que foram expostas a células que expressam o HIV. Lembre-se também de usar células JCA bem conservadas e DNA livre de endotoxinas para otimizar a transfecção.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.