Name: Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T15:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a avaliar a eficácia da imunoterapia com transferência adotiva de linfócitos T citotóxicos em modelo murino de metástase pulmonar. Este método permite quantificar nódulos tumorais usando tinta da Índia.

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Suportada por concessões do National Institutes of Health (CA133085 para KL) e da American Cancer Society (RSG-09-209-01-TBG para KL).

1. Modelo Experimental rato Metástase <ol><li> No dia antes da injeção das células tumorais, uma semente T75 frasco com até 1 x 10 7 CMS4-Met células em 10 mL de meio RPMI contendo 10% de soro para obter rápido crescimento de células tumorais. Incubar durante a 37 ° C. </li><li> No dia da injeção, remova a mídia e lave as células uma vez com PBS, em seguida, colher as células tumorais com 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C por 5 minutos. Parar a reação com 10 mL de meio RPMI contendo 10% de soro. Transferência de células para um tubo cônico. </li><li> Girar as células a 1300 rpm em uma centrífuga Sorvall RT Legend por 3 minutos em temperatura ambiente. Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 10 mL fresco 1X HBSS para lavar, então girar novamente e ressuspender da mesma maneira. </li><li> Contagem de células tumorais em um hemocitômetro. Diluir as células em HBSS, de modo que as células necessárias para cada injeção são ressuspenso em um volume total de 100 mL. </li><li> Aqueça o 6-8 semanas de idade camundongos BALB / c em um copo imersos em água morna para dilatar a veia da cauda. Posicione o mouse em um limitador veia da cauda no banco. Use uma micro para injetar 100 L de células tumorais na veia da cauda lateral. Utilizar técnicas assépticas para evitar a infecção. Após a injeção, aplique uma leve pressão no local da injeção até que o sangramento parou. </li><li> Devolver o mouse para a gaiola, e permitir que o tumor crescer para a fase desejada. </li></ol> 2. Citotóxicos T-linfócitos (CTL) Imunoterapia transferência adotiva <ol><li> No dia da transferência, pipeta cima e para baixo para voltar a suspender citotóxicos purificada linfócitos T, ou CTLs, preparado como descrito no texto. Transferência de todas as células de uma placa para um tubo cônico de 15 mL, não deixando o volume exceder mais de 2 / 3 do tubo. </li><li> Inserir um estéril Pasteur pipeta no tubo cônico e leigos meio de separação de Linfócitos, ou LSM, sob as células até que o volume total se aproxima de 14 mL. </li><li> Tenha cuidado para não perturbar as camadas. Centrifugar a 2000 rpm por 20 minutos em temperatura ambiente. Não use o freio para diminuir o rotor depois de spinning. </li><li> Transferir os CTLs para um novo tubo de 15 mL cônico. Adicionar HBSS a um volume de aproximadamente 10 mL de lavar. </li><li> Contagem das células. Girar a 1300 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Ressuspender em HBSS com a densidade de células necessárias para injeções, mantendo o volume total por injeção de 100 mL. </li><li> Use a técnica de injecção mesma cauda como visto anteriormente neste vídeo para injetar o CTLs em camundongos portadores de tumor. </li><li> Devolver o mouse para a gaiola, e permitir que o CTLs para interagir com o tumor. Camundongos são geralmente sacrificados para análise 14-21 dias após o tratamento CTL. </li></ol> 3. Visualização de metástases pulmonares <ol><li> Para visualizar metástases pulmonares, coloque um rato sacrificado em sua parte traseira em uma placa de isopor. Pinos nas pernas para garantir livre acesso à traquéia. Pulverizar o lado ventral com etanol 70%. </li><li> A partir de meados da década de abdômen, use uma tesoura para cortar ao longo da linha média, através da caixa torácica, e até para as glândulas salivares. Expor a traquéia. Use uma pinça para remover os tecidos em torno da traquéia. </li><li> Um fio de 200 mL ponteira debaixo da traquéia. Segurando a ponta com uma mão, levante suavemente a traqueia para cima e longe do corpo. </li><li> Gire a plataforma de 180 °. Use uma seringa de 50 ml para injetar tinta da Índia para os pulmões através da traquéia. Completamente inflar os pulmões com tinta até sentir uma forte resistência. </li><li> Use uma tesoura para cortar a traquéia. Deslize um par de fórceps sob os pulmões e tirá-los do mouse. Enxágüe os pulmões brevemente em um Copo de 1 litro de água. </li><li> Em uma Cobertura de vapores químicos, a transferência dos pulmões para um frasco de cintilação de vidro contendo 5 mL de solução de Fekete. O tecido do tumor irá emergir como nódulos brancos sobre os pulmões pretos depois de alguns minutos. Os tumores podem ser contados e armazenados em solução Fekete indefinidamente. </li></ol> 4. Metástases representante em Pulmões visualizada <ol><li> Aqui, os pulmões de ratos que foram injetados com carcinoma mamário 4T1 linha celular mostram manchas brancas indicando tumores. Ratos que foram injetados com células 4T1 transfectadas com uma IRF8 K79E dominante negativo do mutante mostrar o potencial metastático maior de células tumorais. </li><li> Estas imagens mostram uma análise histológica da eficácia da imunoterapia transferência CTL adotivos. Tumor-rolamento camundongos injetados com solução salina mostrou tumores múltiplos seis dias mais tarde, indicado por setas amarelas (A). Camundongos injetados com células tumorais específicas T, por outro lado, mostrou uma redução de tumores (B). </li><li> No mesmo experimento, Índia tratamento de tinta dá um jeito mais simples para medir a eficácia da transferência adotiva CTL. Aqui, os nódulos tumorais branco sobre portadores de tumor nos pulmões claramente distingui-los dos pulmões, que têm sido submetidos com sucesso a transferência adotiva CTL, e contando os nódulos permite um graude quantificação não é possível com a histologia. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema experimental para a metástase do tumor experimental e CTL transferência adaptativa modelo de camundongo imunoterapia. Pontos vermelhos indicam as células tumorais e pontos verdes indicam CTLs. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rompimento de IRF8 função aumentaram o potencial metastático das células tumorais. Rato carcinoma mamário 4T1 linhagem de células foi estavelmente transfectadas com vetor (4T1.Vector) ou vector expressar uma IRF8 dominante negativo do mutante K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Células tumorais foram injetadas nas veias da cauda iv do mouse lateral. Tumor-rolamento pulmões foram inflados com tinta nanquim para visualizar nódulos tumorais. Nódulos tumorais são facilmente vistos como manchas brancas sobre o fundo preto do tecido pulmonar. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A análise histológica da eficácia da imunoterapia transferência CTL adotivos. Rato linha celular sarcoma CMS4-Met foi injetado nas veias do mouse iv laterais da cauda. Três dias depois, salina (A) ou células tumorais específicas T (B) foram injetadas em camundongos portadores de tumor. Pulmões foram analisados ​​seis dias após o tratamento CTL pela coloração H &amp; E convencionais histológica. Nódulos tumorais são indicados por setas. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Visualização de nódulos tumorais pela Índia inflação de tinta. Rato linha celular sarcoma CMS4-Met foi injetado nas veias do mouse iv laterais da cauda. Três dias depois, salina (controle) ou células tumorais específicas T (CTL +) foram injetadas em camundongos portadores de tumor. Pulmões foram analisados ​​14 dias após o tratamento CTL. As manchas brancas, que são nódulos tumorais, permitem a quantificação fácil da eficácia do tratamento CTL.

<ol><li>Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+extensive+pulmonary+metastases+in+mice+by+adoptive+transfer+of+antigen-specific+CD8%28%2B%29+CTL+reactive+against+tumor+cells+expressing+a+naturally+occurring+rejection+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope.</a> J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).</li>
<li>Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fas%2FFas+ligand+pathway+is+important+for+optimal+tumor+regression+in+a+mouse+model+of+CTL+adoptive+immunotherapy+of+experimental+CMS4+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases.</a> J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).</li>
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<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
</ol>

Camundongos foram comprados do National Cancer Institute (Friderick, MD) e alojado no Medical College of Georgia instalações para animais. Experimentos e cuidado / bem-estar estavam de acordo com os regulamentos federais e um protocolo aprovado pelo Medical College of Georgia IACUC comitê.

Soluções: Índia Solução de tinta (17): <ol><li> Despeje 150 ml de água destilada para um balão de 250 ml. </li><li> Adicione 4 gotas de hidróxido de amônio à água destilada. </li><li> Adicionar 30 ml de tinta India estoque (ou seja, Sanford Black Magic Ink Drawing Waterproof 4465 item 44011) para a mistura de amônia e água. </li><li> Blusa com água destilada para um volume de 200 ml. Solução está pronta para a injecção. </li></ol> Solução Fekete (17): Fekete solução é usada para branquear nanquim-inflado portadores de tumor nos pulmões para distinguir nódulos tumorais branco do fundo preto do tecido normal. <ol><li> Adicione 350 ml EtOH 95% a garrafa de vidro 1L. </li><li> Adicionar água destilada 150ml </li><li> Adicionar 50ml de formaldeído </li><li> Adicionar 25ml de ácido glacial ácido </li></ol>

metástase experimental e ctl adoptive transferência modelo rato imunoterapia

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Modelo de camundongo experimental de metástase é um modelo simples e metástase ainda fisiologicamente relevantes. As células tumorais são injetadas por via intravenosa (iv) nas veias da cauda do rato e colonizar nos pulmões, assim, assemelhando-se os últimos passos de metástase de células tumorais espontânea: a sobrevivência na circulação extravasamento, e colonização nos órgãos distal. Do ponto de vista terapêutico, o modelo experimental de metástase é o modelo mais simples e ideal uma vez que o alvo das terapias é freqüentemente o ponto final de metástase: estabelecida tumor metastático no órgão distal. Neste modelo, as células tumorais são injetadas nas veias da cauda iv mouse e permitido para colonizar e crescer nos pulmões. Tumor-específico CTLs são injetados iv no mouse metástases de rolamento. O número eo tamanho das metástases de pulmão pode ser controlada pelo número de células tumorais para ser injetada eo tempo de crescimento do tumor. Portanto, vários estágios de metástase, metástase do mínimo para metástases extensas, pode ser modelada. Metástases pulmonares são analisados ​​pela inflação com tinta, permitindo fácil observação visual e quantificação.

Uma metástase pulmonar experimental e modelo de rato CTL imunoterapia para a análise da interação de células tumorais de células-T<em&gt; In vivo</em&gt;.

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

O modelo de camundongo de metástase experimental é um modelo de metástase simples e, ainda assim, fisiologicamente relevante. As células tumorais são injetadas por via intravenosa (i.v.) em...

O objetivo geral deste procedimento é examinar a eficácia da imunoterapia por transferência adotiva de linfócitos T específicos para o tumor in vivo. Isso é realizado primeiramente transplantando células tumorais por injeção na veia caudal lateral dos camundongos, a fim de estabelecer metástases pulmonares. O segundo passo do procedimento consiste em tratar os camundongos portadores de tumor com linfócitos T citotóxicos específicos para o tumor (CTLs).O passo final é usar tinta da Índia como um meio para visualizar e quantificar nódulos tumorais. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a EIC de diferentes tratamentos mediante a medição do tamanho do tumor e a quantificação do número de nódulos tumorais. Olá, meu nome é Mary Zimmerman e sou membro do laboratório do Dr. Kevin Lu na Faculdade de Medicina da Geórgia.Olá, meu nome é Shelene Hu. Sou aluna do segundo ano e também trabalho no laboratório do Dr. Lou. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos tradicionais, como as curvas de sobrevida, é que este procedimento é qualitativo e quantitativo. As implicações da técnica podem estender-se à terapia do câncer, pois simula a imunoterapia adotiva com linfócitos T em pacientes humanos com câncer.Então, vamos começar. No dia anterior às injeções de células tumorais, semeie um frasco T75 com até um vezes 10 à sétima células CMS4-MET em 10 mililitros de meio RPMI contendo 10% de soro. Para obter células tumorais de crescimento rápido, incube durante a noite a 37 graus Celsius no dia da injeção.Remova o meio e lave as células uma vez com PBS, depois recolha as células tumorais com tripsina-EDTA 0,05% a 37 graus Celsius por cinco minutos. Interrompa a reação com 10 mililitros de meio RPMI contendo 10% de soro. Transfira as células para um tubo cônico.Centrifugue as células a 1300 RPM em uma centrífuga val legend RT durante três minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 10 mililitros de uma solução fresca de 1 XHB Ss para lavagem. Em seguida, centrifugue novamente e ressuspenda da mesma maneira.Conte as células tumorais em um hemo.citômetro. Dilua as células em HBSS de modo que as células necessárias para cada injeção fiquem suspensas. Em um volume total de 100 microlitros, aqueça os camundongos B SEA com seis a oito semanas de idade em um béquer imerso em água morna.Para dilatar a veia da cauda, coloque o camundongo em um suporte para veia da cauda sobre a bancada. Use uma seringa micrométrica para injetar 100 microlitros de células tumorais na veia lateral da cauda. Utilize técnica asséptica para evitar infecção após a injeção.Aplicar leve pressão no local da injeção até que o sangramento pare. Retornar o camundongo à gaiola e permitir que o tumor cresça até o estágio desejado. No dia da transferência, pipetar para cima e para baixo para ressuspender os linfócitos T citotóxicos purificados ou LTCs preparados.Conforme descrito no texto, transfira todas as células de uma placa para um tubo cônico de 15 mililitros, sem deixar que o volume exceda dois terços do tubo. Insira uma pipeta de Pasteur estéril no tubo cônico e sobreponha o meio de separação de linfócitos. Meio ou LSM sob as células até que o volume total se aproxime de 14 mililitros.Tenha cuidado para não perturbar as camadas. Centrifugue a 2000 RPM por 20 minutos em temperatura ambiente. Não use o freio para desacelerar o rotor após a centrifugação; transfira os CTLs para um novo tubo cônico de 15 mililitros.Adicione HBSS até um volume de aproximadamente 10 mililitros. Para lavar. Conte as células e centrifugue a 1300 RPM durante cinco minutos. À temperatura ambiente, re-suspenda em HBSS até a densidade celular necessária para as injeções.Mantendo o volume total por injeção em 100 microlitros. Utilize a mesma técnica de injeção na cauda observada anteriormente neste vídeo. Para injetar os CTLs em camundongos com tumor, retorne o camundongo à gaiola e permita que os CTLs interajam com o tumor.Os camundongos geralmente são sacrificados para análise entre 14 e 21 dias após o tratamento com CTL. Para visualizar metástases pulmonares, posicione um camundongo sacrificado em decúbito dorsal sobre uma placa de isopor. Prenda as patas para garantir acesso desobstruído à traqueia.Pulverize o lado ventral com etanol 70%, começando a partir do abdômen médio. Use uma tesoura para cortar ao longo da linha média, atravessando a caixa torácica e subindo em direção às glândulas salivares. Exponha a traqueia.Use uma pin&ccedil;a para remover os tecidos ao redor da traqueia. Passe a ponta de uma pipeta de 200 microlitros por baixo da traqueia, segurando a ponta com uma m&atilde;o. Levante suavemente a traqueia para cima e para longe do corpo.Gire a plataforma 180 graus. Use uma seringa de 50 mililitros para injetar tinta nanquim nos pulmões através da traqueia. Inflar completamente os pulmões com tinta até sentir uma resistência forte.Use uma tesoura para cortar a traqueia. Deslize um par de pinças sob os pulmões e retire-os do camundongo. Enxágue os pulmões brevemente em um béquer de um litro com água em uma capela de exaustão química.Transfira os pulmões para uma instalação de vidro contendo cinco mililitros de solução FTI. O tecido tumoral surgirá como nódulos brancos sobre os pulmões escuros. Após alguns minutos, os tumores podem agora ser contados e mantidos indefinidamente na solução FTI aqui.Pulmões de camundongos transfetados com carcinoma mamário. A linhagem celular quatro T um apresenta manchas brancas indicando tumores. Camundongos transfetados com um IRF oito dominante negativo imune ao K 79 E mostram o potencial metastático aumentado das células tumorais.Essas imagens mostram uma análise histológica da eficácia da imunoterapia por transferência adotiva de LTC. Camundongos com tumor injetados com solução salina apresentaram múltiplos tumores seis dias depois, indicados por setas. Camundongos injetados com linfócitos T específicos para o tumor, por outro lado, mostraram redução dos tumores no mesmo experimento.O tratamento com tinta da Índia oferece uma maneira mais simples de medir a eficácia da transferência adotiva de LTC. Aqui, os nódulos tumorais brancos nos pulmões com tumor os distinguem claramente dos pulmões que realizaram com sucesso a transferência adotiva de LTC, e a contagem dos nódulos permite um grau de quantificação não possível com a histologia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de aquecer os camundongos para facilitar e tornar mais precisas as injeções na veia da cauda.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a eficácia do tratamento por meio deste procedimento simples para quantificar o tamanho e o número de tumores. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Aqui, descrevemos um modelo de xenoenxerto de murina que se assemelha funcionalmente a um reservatório de Ommaya em pacientes. Desenvolvemos a Murine Ommaya para estudar novas terapêuticas para a doença leptomeningeal universalmente fatal.

Um modelo de xenoenxerto Murine Ommaya para estudar terapia direta da doença leptomeningeal

Aqui, apresentamos um protocolo de transplante de tumor para a caracterização de linfócitos derivados de tumores inerentes ao tumor e periferia em um modelo de tumor de camundongos. O rastreamento específico do influxo de células imunes derivadas do receptor com citometria de fluxo revela a dinâmica das alterações fenotípicas e funcionais dessas células durante as respostas imunológicas antitumorais.

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

Este artigo descreve um fluxo de trabalho de técnicas empregadas para testar novos mediadores candidatos de metástase de melanoma e seus mecanismos de ação.

Uma plataforma robusta de descoberta para a identificação de novos mediadores de metástase de melanoma

O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.

Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. O modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal e permite a avaliação de novas drogas terapêuticas em um cenário clinicamente relevante de metástases pulmonares e hepáticas.

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

O desenho experimental aqui apresentado fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases linfonodais (LN), o que exclui a perturbação de células T CD8+ circunstantes.

Modelo de Metástase de Linfonodo Drenante para Avaliação da Dinâmica de Células T CD8+ Antígeno-Específicas Durante a Tumorigênese

Descrevemos um método para utilizar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. Este protocolo tem como objetivo verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas.

Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

Aprenda a avaliar a eficácia da imunoterapia com transferência adotiva de linfócitos T citotóxicos em modelo murino de metástase pulmonar. Este método permite quantificar nódulos tumorais usando tinta da Índia.

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

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