Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

O objetivo geral deste procedimento é examinar a eficácia da imunoterapia com transferência adotiva de linfócitos T específicos para o tumor in vivo. Isso é realizado primeiramente transplantando células tumorais por injeção na veia caudal lateral dos camundongos, a fim de estabelecer metástases pulmonares. O segundo passo do procedimento consiste em tratar os camundongos portadores de tumor com linfócitos T citotóxicos específicos para o tumor (CTLs).

O passo final é utilizar tinta da Índia como um meio para visualizar e quantificar nódulos tumorais. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a EIC de diferentes tratamentos por meio da medição do tamanho do tumor e da quantificação do número de nódulos tumorais. Olá, meu nome é Mary Zimmerman e sou membro do laboratório do Dr. Kevin Lu na Faculdade de Medicina da Geórgia.

Olá, meu nome é Shelene Hu. Sou aluna do segundo ano e também trabalho no laboratório do Dr. Lou. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos tradicionais, como as curvas de sobrevida, é que este procedimento é qualitativo e quantitativo. As implicações da técnica podem estender-se à terapia do câncer, pois simula a imunoterapia adotiva com linfócitos T em pacientes humanos com câncer.

Então, vamos começar. No dia anterior às injeções de células tumorais, semeie um frasco T75 com até um vezes 10 à sétima células CMS4-MET em 10 mililitros de meio RPMI contendo 10% de soro. Para obter células tumorais de crescimento rápido, incube durante a noite a 37 graus Celsius no dia da injeção.

Remova o meio e lave as células uma vez com PBS, depois recolha as células tumorais com tripsina-EDTA a 0,05% a 37 graus Celsius por cinco minutos. Pare a reação com 10 mililitros de meio RPMI contendo 10% de soro. Transfira as células para um tubo cônico.

Centrifugue as células a 1300 RPM em uma centrífuga val legend RT durante três minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 10 mililitros de uma solução fresca de 1 XHB Ss para lavagem. Em seguida, centrifugue novamente e ressuspenda da mesma maneira.

Conte as células tumorais em um hemo.citômetro. Dilua as células em HBSS de modo que as células necessárias para cada injeção fiquem suspensas. Em um volume total de 100 microlitros, aqueça os camundongos B SEA com seis a oito semanas de idade em um béquer imerso em água morna.

Para dilatar a veia da cauda, coloque o camundongo em um suporte para veia da cauda sobre a bancada. Use uma seringa micrométrica para injetar 100 microlitros de células tumorais na veia lateral da cauda. Utilize técnica asséptica para evitar infecção após a injeção.

Use pressão suave no local da injeção até que o sangramento pare. Devolva o camundongo à gaiola e permita que o tumor cresça até o estágio desejado. No dia da transferência, pipete para cima e para baixo para ressuspender os linfócitos T citotóxicos purificados ou LTCs preparados.

Como descrito no texto, transfira todas as células de uma placa para um tubo cônico de 15 mililitros, sem deixar que o volume exceda dois terços do tubo. Insira uma pipeta de Pasteur estéril no tubo cônico e sobreponha o meio de separação de linfócitos. Ou LSM sob as células até que o volume total se aproxime de 14 mililitros.

Tenha cuidado para não perturbar as camadas. Centrifugue a 2000 RPM por 20 minutos em temperatura ambiente. Não utilize o freio para desacelerar o rotor após a centrifugação; transfira os CTLs para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione HBSS até um volume de aproximadamente 10 mililitros. Para lavar. Conte as células e centrifugue a 1300 RPM durante cinco minutos. À temperatura ambiente, reconstitua em HBSS até a densidade celular necessária para as injeções.

Mantendo o volume total por injeção em 100 microlitros. Utilize a mesma técnica de injeção na cauda demonstrada anteriormente neste vídeo. Para injetar os CTLs em camundongos com tumor, retorne o camundongo à gaiola e permita que os CTLs interajam com o tumor.

Normalmente, os camundongos são sacrificados para análise de 14 a 21 dias após o tratamento com CTL. Para visualizar metástases pulmonares, posicione um camundongo sacrificado em decúbito dorsal sobre uma placa de isopor. Prenda as patas para garantir acesso desobstruído à traqueia.

Pulverize o lado ventral com etanol 70%, começando a partir do abdômen médio. Use uma tesoura para cortar ao longo da linha média, atravessando a caixa torácica e subindo em direção às glândulas salivares. Exponha a traqueia.

Use uma pinça para remover os tecidos ao redor da traqueia. Passe a ponta de uma pipeta de 200 microlitros sob a traqueia, segurando a ponta com uma das mãos. Levante suavemente a traqueia para cima e para longe do corpo.

Gire a plataforma 180 graus. Use uma seringa de 50 mililitros para injetar tinta nanquim nos pulmões por meio da traqueia. Infle completamente os pulmões com tinta até sentir uma resistência forte.

Use uma tesoura para cortar a traqueia. Deslize um par de pinças sob os pulmões e retire-os do camundongo. Enxágue os pulmões brevemente em um béquer de um litro com água em uma capela de exaustão química.

Transfira os pulmões para uma instalação de vidro contendo cinco mililitros de solução FTI. O tecido tumoral surgirá como nódulos brancos nos pulmões escuros. Após alguns minutos, os tumores podem agora ser contados e mantidos indefinidamente na solução FTI aqui.

Pulmões de camundongos transfectados com carcinoma mamário. A linhagem celular quatro T um apresenta manchas brancas indicando tumores. Camundongos transfectados com um IRF oito negativo dominante imune ao K 79 E mostram o potencial metastático aumentado das células tumorais.

Essas imagens mostram uma análise histológica da eficácia da imunoterapia por transferência adotiva de LTC. Camundongos com tumor injetados com solução salina apresentaram múltiplos tumores seis dias depois, indicados por setas. Camundongos injetados com linfócitos T específicos para o tumor, por outro lado, mostraram redução dos tumores no mesmo experimento.

O tratamento com tinta da Índia oferece uma maneira mais simples de medir a eficácia da transferência adotiva de LTC. Aqui, os nódulos tumorais brancos nos pulmões com tumor os distinguem claramente dos pulmões que realizaram com sucesso a transferência adotiva de LTC, e a contagem dos nódulos permite um grau de quantificação impossível com a histologia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de aquecer os camundongos para facilitar e tornar mais precisas as injeções na veia da cauda.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a eficácia do tratamento por meio deste procedimento simples para quantificar o tamanho e o número de tumores. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.