Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

O objetivo geral deste procedimento é examinar a eficácia da imunoterapia de transferência adotiva de células T específicas do tumor in vivo. Isso é feito primeiro transplantando células tumorais por meio de injeção lateral na veia da cauda para os camundongos, a fim de estabelecer metástases pulmonares. A segunda etapa do procedimento é tratar os camundongos portadores de tumor com CTLs de linfócitos T citotóxicos específicos do tumor.

A etapa final é usar tinta nanquim como meio de visualizar e quantificar nódulos tumorais. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a CIE de diferentes tratamentos através da medição do tamanho do tumor e da quantificação do número de nódulos tumorais. Olá, meu nome é Mary Zimmerman e sou membro do laboratório do Dr. Kevin Lu na Faculdade de Medicina da Geórgia.

Olá, meu nome é Shelene Hu.Sou estudante do segundo ano e também estou trabalhando no laboratório do Dr.Lou. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos tradicionais, como curvas de sobrevivência, é que esse procedimento é qualitativo e quantitativo. A implicação das técnicas pode se estender à terapia do câncer porque imita a imunoterapia adotiva de células T em pacientes humanos com câncer.

Então, vamos começar: No dia anterior às injeções de células tumorais, semeie um frasco T 75 com até uma vez 10 elevado ao sétimo. CMS quatro células met em 10 mililitros de meio RPMI contendo 10% de soro. Para obter células tumorais de crescimento rápido, incubar durante a noite a 37 graus Celsius no dia da injeção.

Remova o meio e enxágue as células uma vez com PBS, depois colha as células tumorais com 0,05% de tripsina EDTA a 37 graus Celsius por cinco minutos. Pare a reação com 10 mililitros de meio RPMI contendo 10% de soro. Transfira as células para um tubo cônico.

Gire as células a 1300 RPM em uma centrífuga val legend RT por três minutos. À temperatura ambiente, remova o snat, ressuspenda as células em 10 mililitros de um XHB Ss fresco para lavar. Em seguida, gire para baixo novamente e ressuspenda da mesma maneira.

Conte as células tumorais em uma hemo. Citômetro. Diluir as células em HBSS para que as células necessárias para cada injeção sejam ressuspensas. Em um volume total de 100 microlitros, aqueça os camundongos B SEA de seis a oito semanas de idade em um béquer, imerso em água morna.

Para dilatar a veia da cauda, coloque o mouse em um limitador de veias da cauda na bancada. Use uma seringa micros para injetar 100 microlitros de células tumorais na veia lateral da cauda. Use uma técnica séptica para evitar infecção após a injeção.

Aplique uma ligeira pressão no local da injeção até que a hemorragia pare. Retorne o camundongo para a gaiola e permita que o tumor cresça até o estágio desejado. No dia da transferência, pipetar para cima e para baixo para ressuspender os linfócitos T citotóxicos purificados ou CTLs preparados.

Conforme descrito no texto, transfira todas as células de uma placa para um tubo cônico de 15 mililitros, não deixando o volume ultrapassar mais de dois terços do tubo. Insira uma pipeta Pasteur estéril no tubo cônico e coloque a separação de linfócitos. Médio ou LSM sob as células até que o volume total se aproxime de 14 mililitros.

Tenha cuidado para não perturbar as camadas. Centrifugue a 2000 RPM por 20 minutos em temperatura ambiente. Não use o freio para desacelerar o rotor após a rotação, transfira os CTLs para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione HBSS a um volume de aproximadamente 10 mililitros. Lavar. Conte as células girando a 1300 RPM por cinco minutos À temperatura ambiente, ressuspenda um HBSS até a densidade celular necessária para injeções.

Manter o volume total por injeção em 100 microlitros. Use a mesma técnica de injeção de cauda vista anteriormente neste vídeo. Para injetar os CTLs em camundongos portadores de tumor, retorne o camundongo à gaiola e permita que os CTLs interajam com o tumor.

Os camundongos geralmente são sacrificados para análise 14 a 21 dias após o tratamento com CTL. Para visualizar metástases pulmonares, coloque um camundongo sacrificado de costas em uma placa de isopor. Prenda as pernas para garantir o acesso desobstruído à traqueia.

Pulverize o lado ventral com etanol 70% a partir do meio do abdômen. Use uma tesoura para cortar ao longo da linha média através da caixa torácica e em direção às glândulas salivares. Exponha a traqueia.

Use uma pinça para remover os tecidos ao redor da traqueia. Passe uma ponta de pipeta de 200 microlitros por baixo da traqueia segurando a ponta com uma mão. Levante suavemente a traqueia para cima e para longe do corpo.

Gire a plataforma 180 graus. Use uma seringa de 50 mililitros para injetar tinta nanquim nos pulmões através da traqueia. Encha completamente os pulmões com tinta até sentir uma forte resistência.

Use uma tesoura para cortar a traqueia. Deslize um par de pinças sob os pulmões e retire-as do mouse. Enxágue os pulmões brevemente em um copo de um litro de água em um exaustor químico.

Transfira os pulmões para uma bile de instalação de vidro contendo cinco mililitros de solução FTI. O tecido tumoral emergirá como nódulos brancos nos pulmões negros. Após alguns minutos, os tumores agora podem ser contados e iniciar na solução FTI indefinidamente. Aqui.

Pulmões para camundongos transfectados com carcinoma mamário. A linhagem quatro T apresenta manchas brancas indicando tumores. Camundongos transfectados com um IRF oito dominante negativo imune a K 79 E mostram o potencial metastático aprimorado das células tumorais.

Essas imagens mostram uma análise histológica da eficácia da imunoterapia de transferência adotiva CTL. Camundongos portadores de tumor injetados com solução salina mostraram múltiplos tumores seis dias depois indicados por setas. Camundongos injetados com células T específicas do tumor, por outro lado, mostraram uma redução de tumores no mesmo experimento.

O tratamento com tinta nanquim oferece uma maneira mais simples de medir a eficácia da transferência adotiva de CTL. Aqui, os nódulos tumorais brancos nos pulmões portadores de tumor os distinguem claramente dos pulmões que foram submetidos com sucesso à transferência adotiva de CTL e a contagem dos nódulos permite um grau de quantificação que não é possível com histologia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de aquecer os camundongos para injeções mais fáceis e precisas nas veias da cauda.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a eficácia do tratamento por meio desse procedimento simples para quantificar o tamanho e o número de tumores. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.