Name: Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-04T17:32:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Aprenda a induzir lesão renal aguda em larvas de zebrafish por microinjeção de gentamicina na veia cardinal comum. Este método permite visualizar danos tubulares renais por imunohistoquímica.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health EUA (NIH) e concede R01DK069403 P30DK079307.

Parte do protocolo que se segue é baseado em métodos publicados relatado por (Hentschel et al. 2005) e (Weinstein et al. 1995) com ligeiras modificações. Parte 1: Microinjeções Configurar com antecedência para microinjeção <ul><li> Os peixes são injetadas em dois dias pós-fertilização (DPF). Portanto, peixe-zebra adulto são criados três noites antes de um experimento planejado. Coletar embriões e colocá-los em uma placa de Petri com água E3 (NaCl 5mM, 0.17mm KCL, CaCl 2 0,33 mm, 0,33 mm MgSO 4) a 28,5 ° C. No final do primeiro dia remover embriões mortos da placa de Petri e embriões separados para que não haja 8-10 embriões por placa de Petri. </li><li> Prepare as agulhas de vidro puxando a partir de tubos capilares (4 centímetros de comprimento, 0,63 / 0,20 OD / ID milímetros (mm) R-6 Personalizado de vidro Tubulação Drummond sociedade científica, Broomall, PA 9-000-3000) com um puxador de eletrodo. O diâmetro da ponta deve ser de 10-20 mM. Sob um microscópio de dissecação (Leica S6E), com um marcador permanente desenhar cerca de 10 linhas de um milímetro ao longo da agulha, com a ajuda de uma régua, e armazenar as agulhas em um prato de Petri grande em rampas de barro. </li><li> Prepare a pipeta holding: Fire-polonês a ponta de um tubo de vidro de paredes finas borosilicato capilar (152 mm, 1 / 0,75 OD / mm ID TW100-6, Instrumentos de Precisão World, Inc.) com uma chama bico de Bunsen até que o diâmetro interno de a dica é 0,4-0,5 mm. Essa dimensão permite boa aderência do saco vitelino de larvas de peixe-zebra 2 dpf. Segure uma extremidade de um pedaço de vidro capilar usando uma pinça longa, eo calor da ponta oposta com do capilar com o bico de Bunsen, colocando-o verticalmente sobre o cone azul luz interior da chama, a parte mais quente, por 1-2 segundos, implantá-la para obter um mesmo derreter. Repita isso algumas vezes, em seguida, examinar o capilar sob o microscópio, em um micrômetro de estágio (94 de Ward W 9910). Esta é uma etapa crítica, pode ser necessária para disparar um polonês-pipetas segurando poucos e selecione o tamanho apropriado mais tarde, enquanto você está manipulando as larvas. Se você é cuidadoso, segurando uma pipeta tem a duração de sessões de microinjeção múltiplas. </li><li> Encha a bomba Microsseringa Manual (MMP, Precision Mundial Instruments, Inc.), com óleo mineral, seguindo as instruções dadas pelo fabricante. O titular da pipeta é inserido em um manipulador joystick (Narishige, MN-151), ligado com um suporte magnético (Narishige, MN 151) a uma chapa de ferro (Narishige, IP). </li></ul> Microinjeção <ul><li> Prepare 20μl da mistura de injecção:. 2.4μl gentamicina (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml em solução salina) e 10 kDa 17.6μl-lucifer amarelo dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml em solução salina) No peixes controlar o gentamicina é substituído por solução salina. O dextran fluorescente (muitas cores diferentes podem ser usados) é suficiente para verificar a precisão da injeção e selecione larvas que foram injetados com a nephrotoxicant. </li><li> Prepare duas placas de Petri 30 milímetros com óleo mineral 2ml para colocar a mistura de injeção e mistura sob controle, para evitar a evaporação das soluções. </li><li> Prepare o anestésico: 400 mg tricaina pó (etil-m-aminobenzoato metanossulfonato SIGMA A-5040) 97,7 ml de água DD, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Ajustar a pH 7. Conservar a solução estoque no freezer, em alíquotas de 4,2 ml. Para usar tricaina como um anestésico diluir a 4,2 ml solução estoque tricaina em 100 ml de água E3 (Westerfield 1993) e deixar à temperatura ambiente. </li></ul> As seguintes etapas são realizadas sob um microscópio de dissecação <ul><li> Remover manualmente qualquer córions restantes com uma pinça fina e anestesiar o peixe-zebra transferindo-os em um prato de Petri com tricaina aquecido em temperatura ambiente. Peixe-zebra deve ser exposto a tricaina pelo menos 15 minutos antes de iniciar o microinjeções. </li><li> Abra a ponta da agulha de injeção usando uma lâmina de barbear (VWR científica 55411-050). Segure a lâmina com uma ligeira inclinação para criar um chanfro e cortar a ponta, como para obter uma abertura de cerca de diâmetro de 10 20Hm. </li><li> Ligue vácuo de poder, e suprimento de ar do aparelho de microinjeção (World instrumentos de precisão Inc., PV820 pneumáticos picopump). Inserir a agulha no porta-agulha montada sobre a base de micromanipulador e inclinação (Instrumentos Palavra Precision, Inc., Modelo M3301R, TB-1). </li><li> Para preencher a agulha, coloque uma gota (10μl) da solução a ser injetado na placa de Petri 30 milímetros preenchido com óleo mineral (Fisher Chemicals, 0121-1). Vire o micromanipulador manual de forma a submergir a ponta da agulha na gota de solução, defina o picopump "hold / vent" mudar para "desabafar" ("vent" equivale a vácuo no PV820), e preencher a agulha, puxando solução através da ponta da agulha. Isso levará alguns minutos, se a solução entra na agulha muito rápido,isso significa que o diâmetro da ponta é muito grande, e as injeções não serão precisos. Após a agulha é preenchido, defina a picopump para "hold" ("hold" equivale a injetar no PV820). </li><li> Para calibrar a agulha, defina o picopump "gated / timed" mudar para "gated", pressione o pedal para descarregar a agulha, e gravar o tempo que leva (segundos) para o menisco para viajar de uma marcação para o próximo (1 distância total mm). Repita 3 vezes, o tempo médio (em segundos), e dividir o valor por 30 (volume em nanolitros (nl) correspondente a 1 mm de distância linear) para determinar o número de milissegundos necessários para entregar um nl de solução. Ajuste o botão período de intervalo para este número e mover o "gated / timed" mudar para "cronometrado". Agora, o picopump está definido para entregar um pulso 1nl de solução. </li><li> Retire o prato de óleo mineral ea posição do prato de Petri com as larvas sob o microscópio. Grupo o peixe no centro da placa de Petri e foco. </li><li> Coloque a pipeta holding na bomba de micro-manual (MMP, instrumentos de precisão Mundial) no lado oposto do microinjetor, antecipadamente sua ponta para a placa de Petri, e no plano de foco do microscópio. Dobrá-lo com um ângulo bastante superficial, de modo que a ponta da pipeta holding é tocar o fundo da placa de Petri e está perto de horizontal. Certifique-se de não ter qualquer bolha de ar no sistema, o que poderia retardar o tempo de resposta e diminuir a precisão da MMP. </li><li> Mudar para uma maior ampliação no microscópio e usar um cílios superfino com alça (Ted Pella 113) para posicionar o lado dorsal das larvas de peixes para baixo com a gema muito perto da pipeta holding. Segure o peixe larval sugando a gema na pipeta holding girando anti-horário na unidade micrômetro controlar a bomba micro manual. Tome cuidado para não transformar o micrômetro longe demais, como a gema pode estourar se puxou muito profundo para a pipeta holding. Foco na veia cardinal comum, formando, que se encontra sobre a gema, logo abaixo da periderme e é o local do fluxo sanguíneo muito elevado. Com o micromanipulador do aparelho de injeção, guiar a agulha para o desenvolvimento comum veia cardinal. É tipicamente necessário retirar a agulha um pouco para trás após a inserção, como a veia cardinal comum é muito superficial. Injetar 1nl de solução pressionando o pedal, em seguida, solte as larvas da pipeta holding e devolvê-lo à água embrião. Esta é uma etapa crítica, especialmente pela primeira vez, porque requer uma certa quantidade de prática no posicionamento do peixe e controlar a sucção e pressão do equipamento. Se a gema do embrião é adequadamente realizado, com a pipeta de holding, que não vai rolar como a agulha entra. </li><li> Para verificar o sucesso da microinjeção, monitorar a presença do amarelo lucifer dextran no coração do peixe zebra em um microscópio fluorescente. O amarelo lucifer permanece visível no coração durante aproximadamente 20 minutos antes de se dissipar para o sistema circulatório Se a solução é injetada nefrotóxicos corretamente, dentro de 2 horas da injeção você vai ver muito pouco lucifer amarelo dextran restantes no local da injeção. Se a solução é injetada no saco vitelino, um ponto de lucifer amarelo dextran permanecerá no local da injeção. (Fig. 1). Devolver o peixe ao meio E3. </li><li> Dois dias após a injecção, as larvas se desenvolvem edema de pericárdio como conseqüência da diminuição da função renal (Fig. 2). </li></ul> Parte 2: Fixação e imunofluorescência com Na + / K + ATPase de anticorpos (α-6F) <ul><li> Em 4 dpf, coloque entre 10 e 15 zebrafish larval em frascos de vidro 4ml (Weathon, 225.012) e corrigi-los em 1ml Dent (80% MeOH DMSO 20%) por 4 horas à temperatura ambiente. </li><li> Hidratar os embriões em um MeOH classificados / PBT (PBS com 0,5% Tween20) série, 75:25 50:50, 25:75, PBT 100%, pipetagem a solução para fora e adicionando nova solução para o frasco do mesmo (1 ml de solução por frasco), 20 minutos em cada solução. Larvas nunca deve ser exposto ao ar, deixe uma solução pouco cobrindo as larvas quando mudar soluções. </li><li> Remover e substituir PBT 1ml com solução de bloqueio (PBS com DMSO 1%, 0,5% Tween20, soro de cabra 10% normal) durante 3 horas a 4 ° C em um nutator. </li><li> Transferência das larvas em uma microcentrífuga 2ml. Remova o bloqueio de soro e substituir com o anticorpo primário 300 ul em solução de incubação (PBS com DMSO 1%, 0,5% Tween20, 2% soro de cabra normal) durante a noite a 4 ° C em um nutator. Nós usamos um anticorpo monoclonal Na + / K + ATPase de anticorpos (α-6F, sobrenadante, Estudos de Desenvolvimento Hibridoma Bank, Iowa) na diluição de 1:25 </li><li> Remover o anticorpo primário e lavar 3 x 30 minutos com solução de incubação à temperatura ambiente. </li><li> Incubar com anticorpo secundário (cabra anti-camundongo Cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) diluído 1:500 em solução de incubação por 2 horas aRT. </li><li> Lavar 3 x 30 minutos com PBT. </li></ul> Parte 3: incorporação de plástico com JB-4 <ul><li> Desidratar tecidos através de uma série de etanol classificados (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 minutos por etapa. </li><li> Preparar a solução de infiltração: 25 ml de JB-4 Solução Incorporação A (Polysciences 0226A) e 0,24 g de catalisador (Polysciences 02.618). Demora um tempo para o catalisador para dissolver, cerca de 20-30 minutos. A solução pode ser armazenada a 4 ° C até 1 mês. </li><li> Decantar o etanol 100% e substituir com a solução de infiltração de plástico. Colocar os tubos a 4 ° C em um rotador e permitir a infiltração de prosseguir até que o dissipador de larvas para o fundo do frasco de vidro. Este processo geralmente leva cerca de 30 minutos. </li><li> Incorporação de protocolo: Coloque a bandeja de copo de plástico de moldagem (Polysciences, Inc. 16643A) sob um microscópio de dissecação. Transferir as larvas, junto com a solução de infiltração para cobrir, para os copos. A mídia incorporação de plástico é preparado em um pequeno tubo de plástico. Nós normalmente incorporar 4-5 peixes de cada vez, um peixe para cada xícara. Prepare 5-6 ml de plástico incorporação (1,2 ml de solução de incorporação para cada copo) a adição de 35 mL de JB-4 Incorporação Solução "B" (Polysciences Inc. 0226B) para cada ml de solução de infiltração. Adicionar 35 mL de JB-4 Solução Embedding "B" (Polysciences Inc. 0226B) para cada ml de solução de infiltração. Misture bem, pipetando para cima e para baixo com um plástico vezes pipeta Pasteur diversas. Isto é importante porque se não for bem misturada o JB-4 não irá polimerizar adequadamente. Depois de 5ml de plástico incorporação foi preparado, retire a infiltração de plástico de cerca de amostras com uma pipeta Pasteur. Encha o copo com a incorporação de plástico. O plástico deve sair fora do copo, para garantir uma boa pega do titular bloco para o espécime. Para detectar zebrafish túbulos renais, as seções transversais são as melhores. Para este fim, os peixes são incorporados na vertical, cabeça para baixo. Com a ajuda de um cílio com alça fina ou fórceps, periodicamente a posição do peixe na vertical, até que o plástico é duro o suficiente para que eles não se movem a partir de sua posição. Demora cerca de 20-30 minutos. Então, coloque o Titular EBH-2 Block (Polysciences Inc. 15.899) sobre os copos e deixe a bandeja a 4 ° C durante a noite. Quando polimerização em completa, você pode sair como os blocos de cubos de gelo. </li><li> Protocolo de incorporação de múltiplas alternativas para as larvas: Encha até a metade com moldes completa JB-4 e deixe-a polimerizar. Para os 15 milímetros quadrados moldes usamos o volume JB-4 em 700μl para encher o molde pela metade. Em seguida, adicione as larvas JB-4 embebido com endurecedor para a pré-polimerizado meio-cheio moldes. Orientar as larvas com a cabeça apontando para o lado mais longo do molde e alinhar as larvas para que o line up olhos (você pode colocar 10 peixes em um único molde em uma linha). Depois que o bloco é polimerizado você pode cortar as bordas do bloco, transformá-lo de modo que o lado está a enfrentar a faca e super cola-lo para um plástico "chuck" que se encaixa no micrótomo. Com este método você pode posicionar um grande número de larvas no mesmo bloco, centrado no plástico, e pronto para seções transversais. O cuidado deve ser tomado orientar o bloco para a faca de modo que as seções equivalentes de cada peixe são tomadas em uma única seção. Isso pode ser feito enquanto o corte através dos olhos, ou seja, orientar o bloco de modo que as seções equivalentes dos olhos são tomadas para cada peixe. O resultado final é que você pode analisar muitos peixes concomitantemente em uma única lâmina de microscopia. </li></ul> Parte 4: Seccionamento <ul><li> Definir a amostra no suporte chuck do micrótomo (usamos um Shandon Finesse Thermo Electro Corporação micrótomo) </li><li> Definir o slide mais quente a 45 ° C. </li><li> Despeje a água DI, para um copo e coloque-o perto do micrótomo </li><li> Antes de seccionamento, certifique-se o bloco é orientada de modo a se obter perfeita secções transversais do peixe. A orientação alavancas de ajuste de cabeça pode ser girada permitindo que a posição do cabeçote da amostra com precisão para a faca. Iniciar o corte de espessura através da cabeça do peixe. Enquanto o corte através dos olhos, orientar o bloco de modo que as seções equivalentes dos olhos são tomadas para cada peixe. Quando as barbatanas peitorais aparecem nas seções, que é quando os túbulos pronephric começar. A partir deste ponto, cortar cerca de 32 hm 4 seções do bloco. </li><li> Recolher as seções com uma pinça e deixe-as cair no copo com água, sem tocar a água com a pinça. A seção vai expandir assim que atinge a superfície da água, agora você pode cobrá-lo em um slide. Inserir o slide para a água em um ângulo de 45 ° e abordagem a seção com a ajuda de um cílio com alça, tocando só as fronteiras da seção. </li><li> Incubar as lâminas em um slide mais quente até que esteja completamente seco. </li><li> Seções imagem usando microscopia de epifluorescência ou confocal. </li></ul> Parte 5: Representante Results Quando realizada corretamente, peixes injetados aparecer como na figura 1, com pouco fluorescentes dextran (neste caso, Lucifer Yellow) visível no coração e no sistema circulatório. Se a injecção é muito profundo, material injetado pode ser visto concentrada no saco vitelino, ou o coração pode ser perfurada causando sangramento excessivo. Se a pipeta holding é feita corretamente, o peixe não vai rolar ou mover quando injetado, e isso vai permitir uma injecção mais precisas. Além disso, é importante certificar-se de não ter qualquer bolha de ar no PDM, o que poderia retardar o tempo de resposta e diminuir a precisão do sistema. Geralmente, como conseqüência de nefrotoxicidade gentamicina, 80% dos peixes injetados desenvolver edema de pericárdio (Fig. 2). Usamos um sistema de classificação baseado fenótipo, em que os peixes com edema moderado mostrar edema de pericárdio evidente, mas os outros não observáveis ​​fenótipos, enquanto que os peixes severamente edematoso mostrar edema pericárdico e tronco, com ligeira a moderada curvatura do eixo. Usando um anticorpo contra o túbulo renal Na + / K + ATPase (α-6F) podemos visualizar os túbulos danificado em seções transversais, com uma perda evidente de polaridade celular e interrupção tubular nos túbulos danificado em comparação aos controles (Fig. 3). Este padrão é consistente através de múltiplos cortes transversais. A fim de obter perfeita secções transversais dos túbulos renais é importante para posicionar o peixe corretamente durante a incorporação. Ao comparar seções, nadadeiras peitorais e túbulos proximal convoluted são usados ​​como marcadores anatômicos. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microinjeção nefrotoxina. (A) de injeção de sucesso de um dextran 10kDa conjugado com lucifer amarelo, com expressão fraca na veia comum cardinal, seta branca. (B) a injeção incorreta, resultando em um depósito de 10kDa dextran conjugado com amarelo lucifer que não se dissipa para o sistema circulatório, seta vermelha. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Gentamicina mediado edema. (A) Controle injetado zebrafish larval. Gentamicina injetado zebrafish larval com (B) ou moderada (C) edema grave. Todas as larvas são menos 4 dpf com anterior para a esquerda e dorsal é para cima. Setas pretas apontam para edema pericárdico em B e C. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. AKI imuno-histoquímica. α-6F coloração de anticorpos para ATPase Na + + / K-48 horas após a injecção de gentamicina (4 larvas dpf) no controle (A, B) e injetados gentamicina (C, D) larvas. A, C estão em 20X de ampliação e de B e D são 3X ampliações digitais dos túbulos direito em A e C. Nota perda de polaridade basolateral e ruptura dos túbulos, seta branca, em D, em comparação com B.

<ol><li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li>
<li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock%2C+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University Oregon Press. Oregon. (1993).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo de vídeo demonstramos uma técnica de microinjeção intravenosa por um modelo de LRA, através da criação de gentamicina danos proximal mediada tubular em larvas do peixe. Este dano resulta na formação de pericárdio e / ou edema bruto, refletindo uma incapacidade de regular o equilíbrio hídrico. Nós também descreveu um experimento imuno-histoquímica com um anticorpo que marca túbulos renais diferenciados (Majumdar et al. 2000), mostrando a perda da polaridade celular e uma interrupção do túbulo proximal nos rins danificados. Microinjeções intravenosa representam um método eficiente para a entrega de uma substância solúvel na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra. Esta técnica é uma excelente ferramenta para a introdução de uma variedade de substâncias e com a ajuda de uma injeção uniforme marcador fluorescente pode ser repetido muitas vezes permitindo a resultados consistentes.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;6F monoclonal de camundongo </td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte para bloco EBH-2</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicatado</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-6</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares R-6, tubos de vidro personalizados </td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3000</td><td></td></tr><tr><td>Pó de catalisador</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>155-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Dextrana 10k amarelo de luciferina, fixável por lisina</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Cílio</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8648</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro de 4 ml</td><td>Weathon</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ferro</td><td>Narishige International</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Solução de inclusão JB-4 A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A</td><td></td></tr><tr><td>Solução de inclusão JB-4 B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador com alavanca de comando</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Bomba microsiringa manual</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de microinjeção</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Shandon Finesse</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral, leve</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-1</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de pipetas</td><td>Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de copo plástico para moldagem</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16643A</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de lâminas</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrômetro de estágio </td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Base inclinável</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TB 1</td><td></td></tr><tr><td>Pó de tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td>Microscópio estereoscópico</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td>Microscópio fluorescente</td></tr></tbody></table>

microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o estudo de lesão renal aguda

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Neste artigo de vídeo descrevemos um modelo de zebrafish AKI utilizando gentamicina como o nephrotoxicant. A técnica consiste em microinjeções intravenosa em 2 zebrafish dpf. Esta técnica representa um método eficiente e rápido para entregar substâncias solúveis na corrente sangüínea de larvas de peixe-zebra, permitindo a injeção de peixes 15-20 por hora. Além AKI estudos, esta técnica de microinjeção também pode ser usado para outros tipos de estudos experimentais, como a angiografia. Nós fornecemos um protocolo detalhado da técnica de equipamentos necessários para medidas visuais da função renal diminuída. Além disso, também queremos demonstrar o processo de fixação imunohistoquímica montagem, toda com um marcador túbulos renais, a incorporação de plástico e secção do peixe-zebra larval. Nós demonstramos que larvas do peixe injetada com gentamicina mostram características morfológicas consistentes com AKI: edema, perda da polaridade celular em células epiteliais tubulares proximais e interrupção morfológica do túbulo.

Descrevemos uma técnica de microinjecting a aminoglicosídeos, gentamicina, em dois dias pós-fetilization (dpf) larvas de peixe-zebra para induzir lesão renal aguda (IRA). Nós também descrevem um método para montar toda a imunohistoquímica, plástico incorporação e secção de larvas de peixe-zebra para visualizar os danos mediados AKI.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

Neste artigo em vídeo, descrevemos um modelo de LRA em peixe-zebra utilizando gentamicina como agente nefrotóxico. A técnica consiste em microinjeções intravenosas ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo de lesão renal aguda em peixe-zebra utilizando a glicósido AMG Gentamicina como nefrotoxina. Isso é realizado primeiramente por meio da injeção de gentamicina na veia cardinais comum de larvas de peixe-zebra dois dias após a fertilização. O segundo passo do procedimento consiste em avaliar os fenótipos de emus em larvas injetadas quatro dias após a fertilização.O terceiro passo do procedimento é processar peixes-zebra quatro dias após a fertilização para coloração de imunohistoquímica com um anticorpo para o epitélio do túbulo renal am. O passo final do procedimento é seccionar os peixes-zebra, larvas, e visualizar os túbulos danificados devido à perda de polaridade celular e à ruptura da estrutura do túbulo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram segmentos de túbulos renais danificados por meio de imunohistoquímica com um anticorpo para epitélio renal.Olá, sou Carala San Cosentino do Laboratório Neil Hari, do Departamento de Biologia do Desenvolvimento da Universidade de Pittsburgh. Hoje vamos mostrar um procedimento para microinjetar o aminoglicosídeo Gentamicina em larvas de peixe-zebra com dois dias pós-fertilização. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para induzir lesão renal aguda em larvas de peixe-zebra.Então vamos começar. Inicie cruzando peixes-zebra adultos três noites antes do experimento planejado. Para estagiar embriões em dois dias após a fertilização, prepare o meio E3 usando cloreto de sódio 5 milimolar, cloreto de potássio 0,17 milimolar, cloreto de cálcio 0,33 milimolar, sulfato de magnésio 0,33 milimolar, colete os embriões e coloque-os em uma placa de Petri com água E3 aquecida em um incubador a 28,5 graus Celsius.Remova todos os embriões mortos da placa de Petri ao final do primeiro dia. Separe os embriões em 80 a 100 por placa de Petri. Prepare agulhas de injeção de vidro puxando tubos capilares até um diâmetro final de aproximadamente 10 a 20 micrômetros com um puxador de eletrodos.Após puxar, coloque a micropipeta sob um microscópio estereoscópico e use uma régua para marcar aproximadamente dez linhas de um milímetro ao longo da agulha com uma caneta permanente. Armazene as agulhas em uma placa de Petri grande sobre rampas de argila. Em seguida, prepare a pipeta de fixação por aquecimento com chama.Polimento da ponta de uma capilar de vidro de borossilicato de parede fina. Segure o capilar de vidro usando pinças longas e aqueça a ponta do capilar colocando-a verticalmente sobre o cone interno azul claro da chama por um a dois segundos. Rode o capilar para obter uma fusão uniforme.Repita isso algumas vezes, depois examine a capilar sob um micrômetro de estágio. A capilar deve ter de 0,4 a 0,5 milímetros de diâmetro. Após preparar as capilares e os suportes, encha a bomba microssegadora manual com óleo mineral seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.Insira o porta-pipetas em um manipulador joystick conectado, por meio de um suporte magnético, a uma placa de ferro. Prepare 20 microlitros da mistura de injeção de nefrotoxina. 2,4 nanolitros de gentamicina e 17,6 nanolitros de dextrano amarelo de luciferina no rva controle.A gentamicina é substituída pela solução salina. Prepare dois recipientes de Petri de 30 milímetros com dois mililitros de óleo mineral próximo ao microscópio de injeção para depositar as misturas nefrotóxica e controle antes da injeção. Prepare a anestesia dissolvendo 400 miligramas de pó de trica em 97,7 mililitros de água bidestilada e 2,1 mililitros de triss um molar e ajustando para pH sete.Armazene esta solução estoque no congelador em Eloqua de 4,2 mililitros. Para usar trica como anestésico, dilua a solução estoque de trica de 4,2 mililitros em 100 mililitros de E três e deixe em temperatura ambiente. Para preparar larvas para injeção sob um microscópio estereoscópico, remova manualmente as coons com pinças finas. Anestesie as larvas de peixe-zebra transferindo-as para uma placa de Petri com trica aquecida à temperatura ambiente.As larvas de peixe-zebra devem ser expostas à trica por pelo menos 15 minutos. Antes de iniciar as microinjeções, abra a ponta da agulha de injeção usando uma lâmina de barbear. Segure a lâmina em um ângulo ligeiramente inclinado para criar um bisel e corte a ponta de forma a obter uma abertura de aproximadamente 10 a 20 mícrons de diâmetro.Ligue a alimentação elétrica e o fornecimento de ar para o aparelho de microinjeção. Insira a agulha no suporte da agulha. Encha a agulha colocando uma gota de 10 microlitros da solução de injeção na placa de Petri contendo óleo.Sob o microscópio, ligue a bomba de pico manual e submerja a ponta da agulha na gota. Na gota, configure a bomba de pico para ventilar e preencher a agulha. Isso levará alguns minutos.Se a solução entrar na agulha muito rapidamente, o diâmetro da ponta é grande demais e as injeções não serão precisas. Após a agulha ser preenchida, configure a bomba de pico para manter, a fim de calibrar a agulha, e coloque a chave da bomba de pico na posição acionada por pulso. Pressione o pedal com o pé para descarregar a agulha e registre o tempo, em segundos, necessário para o menisco percorrer de uma marca de milímetro até a próxima; repita este procedimento três vezes e divida o tempo médio por 30, que corresponde ao volume em nanolitros associado à distância linear de um milímetro, obtendo assim o número de milissegundos necessários para liberar um nanolitro da solução.Ajuste o botão do período de intervalo para este número e mova o interruptor de tempo com porta para "temporizado". Agora, a bomba de pulso está configurada para entregar um pulso de um nanolitro da solução. Em seguida, posicione a placa de Petri com as larvas sob o microscópio.Agrupe as larvas no centro da placa de Petri e foque o microscópio. Coloque a pipeta de contenção na seringa micro manual acoplada ao microinjetor, no lado oposto, e avance sua ponta até a placa de Petri, posicionando-a no plano de foco do microscópio. Dobre-a com um ângulo bastante suave, de modo que a ponta extremidade da pipeta de contenção toque o fundo da placa de Petri e fique próxima à posição horizontal.Altere para uma ampliação maior no microscópio e utilize um cílio super fino com cabo. Posicione o peixe-zebra larval com o lado dorsal voltado para baixo, com a gema muito próxima à pipeta de contenção. Gire o micrômetro que controla a bomba de seringa manual no sentido anti-horário para segurar o peixe-zebra larval sugando a gema para dentro da pipeta de contenção.Tenha cuidado para não girar o micrômetro muito além, pois a gema pode estourar. Se for puxada muito profundamente para dentro da pipeta de contenção, foque na veia cardina comum em formação, que se situa sobre a gema logo abaixo do periderma e é um local de alto fluxo sanguíneo. Com o micromanipulador do aparelho de injeção.Guie a agulha para dentro da veia cardial comum em desenvolvimento. Geralmente é necessário recuar um pouco a agulha após a inserção, pois a veia cardial comum é muito superficial. Se a gema da larva for adequadamente segurada com a pipeta de contenção, ela não girará quando a agulha entrar.Injete um nanolitro da solução pressionando o pedal do pé. Em seguida, libere as larvas da pipeta de contenção e retorne-as à água das larvas. Para verificar o sucesso da microinjeção, monitore a presença do dextrano amarelo de luciferina no coração das larvas de peixe-zebra.Sob um microscópio fluorescente, o amarelo de luciferina permanece visível no sistema circulatório por aproximadamente 20 minutos; retorne as larvas para meio E3 fresco em quatro dias após a fertilização. Coloque entre 10 e 15 larvas de peixe-zebra em frascos de vidro de quatro mililitros e fixe-as em um mililitro de dents por quatro horas à temperatura ambiente. Reidrate as larvas em uma série de metanol P-B-T-P-B-S com 0,5% em gradiente de 20, 75 para 25, 50 para 50, 25 para 75, até 100% PBT, pipetando a solução para fora e adicionando nova solução ao mesmo frasco.Um mililitro de solução por frasco. Vinte minutos em cada solução. As larvas nunca devem ser expostas ao ar.Mantenha sempre um pouco de solução cobrindo as larvas. Ao trocar as soluções, remova o PBT e substitua por um mililitro de solução bloqueadora PBS com 1% de DMSO e 0,5% a 10% de soro de cabra normal por três horas a quatro graus Celsius em um agitador. Transfira as larvas para um eppendorf de dois mililitros.Remova o soro bloqueador e substitua por 300 microlitros de anticorpo primário. Um anticorpo monoclonal contra sódio potássio em TPS na diluição de um para 25, alfa seis F supernatante, e 300 microlitros de solução de incubação PBS com 1% de DMSO, 0,5% de tween 20 e 2% de soro de cabra normal, incubado durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador. Remova o anticorpo primário e lave três vezes, por 30 minutos cada, com um mililitro de solução de incubação à temperatura ambiente, colocando em um agitador para cada lavagem.Em seguida, incubar com anticorpo secundário diluído na proporção de um para 500 na solução de incubação por duas horas à temperatura ambiente. Após essa lavagem, realizar três lavagens de 30 minutos cada com PBT, desidratar as larvas por meio de uma série gradiente de etanol, mantendo por 10 minutos em cada etapa. Preparar a solução de infiltração utilizando 25 mililitros da solução de inclusão JB4 A e 0,24 gramas de catalisador, dissolvendo por 20 a 30 minutos. A solução pode ser armazenada a quatro graus Celsius por até um mês.Remova o etanol a 100% e substitua pela solução de infiltração plástica. Coloque os tubos a quatro graus Celsius em um rotador e permita que a infiltração prossiga por cerca de 30 minutos, até que as larvas afundem até o fundo do tubo. Para embutir as larvas, posicione a bandeja de moldagem plástica sob um microscópio estereoscópico.Transfira as larvas junto com solução de infiltração suficiente para cobri-las para dentro dos copos. O meio de inclusão plástico é preparado em um pequeno tubo de plástico. Normalmente incluímos quatro a cinco larvas por vez, utilizando uma larva para cada copo, e preparamos cinco mililitros de plástico de inclusão.Adicione 35 microlitros de JB quatro, solução de inclusão B, para cada mililitro da solução de infiltração, misturando bem por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta de plástico ou pipeta plástica várias vezes para garantir que o JB quatro polimerize adequadamente. Após a preparação de cinco mililitros de plástico de inclusão, remova o plástico de infiltração das amostras redondas com uma pipeta de plástico. Encha o copo com plástico de inclusão; o plástico deve escorrer para fora do copo para garantir uma boa aderência do suporte do bloco ao espécime.Para detectar túbulos renais de peixe-zebra, as seções transversais são as melhores para esse propósito. As larvas devem ser embutidas verticalmente, com a cabeça para baixo, com a ajuda de um cílio com cabo ou pinça fina.Posicione periodicamente as larvas verticalmente até que o plástico esteja rígido o suficiente para que elas não saiam de sua posição. Isso leva cerca de 20 a 30 minutos. Em seguida, coloque o suporte duplo EVH sobre os copos e deixe a bandeja a quatro graus Celsius durante a noite até que a polimerização esteja completa.Coloque a amostra no porta-bloco do micrótomo e ajuste o aquecedor de lâminas a 45 graus Celsius. Despeje água desionizada em um béquer e coloque-o próximo ao micrótomo antes do corte. Certifique-se de que o bloco esteja orientado de forma a obter cortes transversais perfeitos das larvas.As alavancas de ajuste da orientação da cabeça podem ser giradas e a luz de fundo na posição da amostra. Corte seções espessas através da cabeça. Oriente os blocos de modo que seções equivalentes dos olhos sejam obtidas para cada larva.Quando as nadadeiras peitorais aparecerem nas seções, é quando os túbulos pronefrídicos começam. A partir desse ponto, corte aproximadamente 32 fatias de seção de 4 mícrons dos blocos. Colete as seções com pinça e deixe-as cair no béquer com água sem tocar a água com a pinça.A seção se expandirá assim que atingir a superfície da água. Agora você pode coletá-la em uma lâmina. Insira a lâmina na água em um ângulo de 45 graus e aproxime-se da seção com a ajuda de um cílio com cabo, tocando apenas as bordas da seção, incube as lâminas em um aquecedor de lâminas até que estejam completamente secas e visualize as seções utilizando microscopia epifluorescente ou confocal.Quando realizada corretamente, uma larva injetada aparece como mostrado aqui na imagem superior, com o dextrano amarelo fluorescente de luciferase no sistema vascular das larvas. Se a injeção for muito profunda, como na imagem inferior, o material injetado pode ser visto no saco vitelino ou o coração pode ser perfurado, causando sangramento excessivo. As larvas desenvolveram edema pericárdico como consequência da nefrotoxicidade da gentamicina, conforme observado aqui.As larvas controle na parte superior não exibem edema pericárdico. No entanto, quando injetadas com gentamicina, 80% das larvas de peixe-zebra exibem edema moderado ou grave, conforme indicado pelas setas nos painéis central e inferior. Utilizamos um sistema de classificação baseado em fenótipos, no qual larvas com edema moderado apresentam edema pericárdico evidente, mas nenhum outro fenótipo observável.Enquanto larvas gravemente edemaciadas apresentam edema pericárdico e do tronco, ausência de circulação no tronco e curvatura acessória leve a moderada utilizando um anticorpo contra túbulos renais direcionado à ATPase de sódio-potássio. Os túbulos danificados são visualizados em cortes transversais com perda evidente da polaridade celular nos painéis C e D e ruptura tubular nos túbulos lesados, em comparação com os controles nos painéis A e B. Este padrão é consistente em múltiplos cortes transversais ao comparar seções. As barbatanas fatoriais e os túbulos contorcidos proximais são utilizados como marcadores anatômicos.Acabamos de mostrar como induzir lesão renal aguda em peixes-zebra larvais. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar agulhas de injeção com diâmetro entre 10 e 20 micrômetros. Pode ser necessário polir com chama algumas pipetas de retenção para obter os tamanhos adequados, mas, uma vez obtida uma adequada, você pode simplesmente mantê-la, pois ela pode durar por várias sessões de injeção.Além disso, é importante garantir que não haja bolhas de ar no aparelho micro série JA, pois isso reduziria a posição do sistema. Por fim, posicione o peixe verticalmente durante a inclusão, a fim de obter uma seção transversal perfeita do túbulo renal. É isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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