Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo de lesão renal aguda em peixe-zebra utilizando a glicósido AMG Gentamicina como nefrotoxina. Isso é realizado primeiramente por meio da injeção de gentamicina na veia cardinais comum de larvas de peixe-zebra dois dias após a fertilização. O segundo passo do procedimento consiste em avaliar os fenótipos de emus em larvas injetadas quatro dias após a fertilização.

O terceiro passo do procedimento é processar peixes-zebra quatro dias após a fertilização para coloração de imunohistoquímica com um anticorpo para o epitélio do túbulo renal am. O passo final do procedimento é seccionar os peixes-zebra, larvas, e visualizar os túbulos danificados devido à perda de polaridade celular e à ruptura da estrutura do túbulo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram segmentos de túbulos renais danificados por meio de imunohistoquímica com um anticorpo para epitélio renal.

Olá, sou Carala San Cosentino do Laboratório Neil Hari, do Departamento de Biologia do Desenvolvimento da Universidade de Pittsburgh. Hoje vamos mostrar um procedimento para microinjetar o aminoglicosídeo Gentamicina em larvas de peixe-zebra com dois dias pós-fertilização. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para induzir lesão renal aguda em larvas de peixe-zebra.

Então vamos começar. Inicie cruzando peixes-zebra adultos três noites antes do experimento planejado. Para estagiar embriões em dois dias após a fertilização, prepare o meio E3 usando cloreto de sódio 5 milimolar, cloreto de potássio 0,17 milimolar, cloreto de cálcio 0,33 milimolar, sulfato de magnésio 0,33 milimolar, colete os embriões e coloque-os em uma placa de Petri com água E3 aquecida em um incubador a 28,5 graus Celsius.

Remova todos os embriões mortos da placa de Petri ao final do primeiro dia. Separe os embriões em 80 a 100 por placa de Petri. Prepare agulhas de injeção de vidro puxando tubos capilares até um diâmetro final de aproximadamente 10 a 20 micrômetros com um puxador de eletrodos.

Após puxar, coloque a micropipeta sob um microscópio estereoscópico e use uma régua para marcar aproximadamente dez linhas de um milímetro ao longo da agulha com uma caneta permanente. Armazene as agulhas em uma placa de Petri grande sobre rampas de argila. Em seguida, prepare a pipeta de fixação por aquecimento com chama.

Polimento da ponta de uma capilar de vidro de borossilicato de parede fina. Segure o capilar de vidro usando pinças longas e aqueça a ponta do capilar colocando-a verticalmente sobre o cone interno azul claro da chama por um a dois segundos. Rode o capilar para obter uma fusão uniforme.

Repita isso algumas vezes, depois examine a capilar sob um micrômetro de estágio. A capilar deve ter de 0,4 a 0,5 milímetros de diâmetro. Após preparar as capilares e os suportes, encha a bomba microssegadora manual com óleo mineral seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.

Insira o porta-pipetas em um manipulador joystick conectado, por meio de um suporte magnético, a uma placa de ferro. Prepare 20 microlitros da mistura de injeção de nefrotoxina. 2,4 nanolitros de gentamicina e 17,6 nanolitros de dextrano amarelo de luciferina no rva controle.

A gentamicina é substituída pela solução salina. Prepare dois recipientes de Petri de 30 milímetros com dois mililitros de óleo mineral próximo ao microscópio de injeção para depositar as misturas nefrotóxica e controle antes da injeção. Prepare a anestesia dissolvendo 400 miligramas de pó de trica em 97,7 mililitros de água bidestilada e 2,1 mililitros de triss um molar e ajustando para pH sete.

Armazene esta solução estoque no congelador em Eloqua de 4,2 mililitros. Para usar trica como anestésico, dilua a solução estoque de trica de 4,2 mililitros em 100 mililitros de E três e deixe em temperatura ambiente. Para preparar larvas para injeção sob um microscópio estereoscópico, remova manualmente as coons com pinças finas. Anestesie as larvas de peixe-zebra transferindo-as para uma placa de Petri com trica aquecida à temperatura ambiente.

As larvas de peixe-zebra devem ser expostas à trica por pelo menos 15 minutos. Antes de iniciar as microinjeções, abra a ponta da agulha de injeção usando uma lâmina de barbear. Segure a lâmina em um ângulo ligeiramente inclinado para criar um bisel e corte a ponta de forma a obter uma abertura de aproximadamente 10 a 20 mícrons de diâmetro.

Ligue a alimentação elétrica e o fornecimento de ar para o aparelho de microinjeção. Insira a agulha no suporte da agulha. Encha a agulha colocando uma gota de 10 microlitros da solução de injeção na placa de Petri contendo óleo.

Sob o microscópio, ligue a bomba de pico manual e submerja a ponta da agulha na gota. Na gota, configure a bomba de pico para ventilar e preencher a agulha. Isso levará alguns minutos.

Se a solução entrar na agulha muito rapidamente, o diâmetro da ponta é grande demais e as injeções não serão precisas. Após a agulha ser preenchida, configure a bomba de pico para manter, a fim de calibrar a agulha, e coloque a chave da bomba de pico na posição acionada por pulso. Pressione o pedal com o pé para descarregar a agulha e registre o tempo, em segundos, necessário para o menisco percorrer de uma marca de milímetro até a próxima; repita este procedimento três vezes e divida o tempo médio por 30, que corresponde ao volume em nanolitros associado à distância linear de um milímetro, obtendo assim o número de milissegundos necessários para liberar um nanolitro da solução.

Ajuste o botão do período de intervalo para este número e mova o interruptor de tempo com porta para "temporizado". Agora, a bomba de pulso está configurada para entregar um pulso de um nanolitro da solução. Em seguida, posicione a placa de Petri com as larvas sob o microscópio.

Agrupe as larvas no centro da placa de Petri e foque o microscópio. Coloque a pipeta de contenção na seringa micro manual acoplada ao microinjetor, no lado oposto, e avance sua ponta até a placa de Petri, posicionando-a no plano de foco do microscópio. Dobre-a com um ângulo bastante suave, de modo que a ponta extremidade da pipeta de contenção toque o fundo da placa de Petri e fique próxima à posição horizontal.

Altere para uma ampliação maior no microscópio e utilize um cílio super fino com cabo. Posicione o peixe-zebra larval com o lado dorsal voltado para baixo, com a gema muito próxima à pipeta de contenção. Gire o micrômetro que controla a bomba de seringa manual no sentido anti-horário para segurar o peixe-zebra larval sugando a gema para dentro da pipeta de contenção.

Tenha cuidado para não girar o micrômetro muito além, pois a gema pode estourar. Se for puxada muito profundamente para dentro da pipeta de contenção, foque na veia cardina comum em formação, que se situa sobre a gema logo abaixo do periderma e é um local de alto fluxo sanguíneo. Com o micromanipulador do aparelho de injeção.

Guie a agulha para dentro da veia cardial comum em desenvolvimento. Geralmente é necessário recuar um pouco a agulha após a inserção, pois a veia cardial comum é muito superficial. Se a gema da larva for adequadamente segurada com a pipeta de contenção, ela não girará quando a agulha entrar.

Injete um nanolitro da solução pressionando o pedal do pé. Em seguida, libere as larvas da pipeta de contenção e retorne-as à água das larvas. Para verificar o sucesso da microinjeção, monitore a presença do dextrano amarelo de luciferina no coração das larvas de peixe-zebra.

Sob um microscópio fluorescente, o amarelo de luciferina permanece visível no sistema circulatório por aproximadamente 20 minutos; retorne as larvas para meio E3 fresco em quatro dias após a fertilização. Coloque entre 10 e 15 larvas de peixe-zebra em frascos de vidro de quatro mililitros e fixe-as em um mililitro de dents por quatro horas à temperatura ambiente. Reidrate as larvas em uma série de metanol P-B-T-P-B-S com 0,5% em gradiente de 20, 75 para 25, 50 para 50, 25 para 75, até 100% PBT, pipetando a solução para fora e adicionando nova solução ao mesmo frasco.

Um mililitro de solução por frasco. Vinte minutos em cada solução. As larvas nunca devem ser expostas ao ar.

Mantenha sempre um pouco de solução cobrindo as larvas. Ao trocar as soluções, remova o PBT e substitua por um mililitro de solução bloqueadora PBS com 1% de DMSO e 0,5% a 10% de soro de cabra normal por três horas a quatro graus Celsius em um agitador. Transfira as larvas para um eppendorf de dois mililitros.

Remova o soro bloqueador e substitua por 300 microlitros de anticorpo primário. Um anticorpo monoclonal contra sódio potássio em TPS na diluição de um para 25, alfa seis F supernatante, e 300 microlitros de solução de incubação PBS com 1% de DMSO, 0,5% de tween 20 e 2% de soro de cabra normal, incubado durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador. Remova o anticorpo primário e lave três vezes, por 30 minutos cada, com um mililitro de solução de incubação à temperatura ambiente, colocando em um agitador para cada lavagem.

Em seguida, incubar com anticorpo secundário diluído na proporção de um para 500 na solução de incubação por duas horas à temperatura ambiente. Após essa lavagem, realizar três lavagens de 30 minutos cada com PBT, desidratar as larvas por meio de uma série gradiente de etanol, mantendo por 10 minutos em cada etapa. Preparar a solução de infiltração utilizando 25 mililitros da solução de inclusão JB4 A e 0,24 gramas de catalisador, dissolvendo por 20 a 30 minutos. A solução pode ser armazenada a quatro graus Celsius por até um mês.

Remova o etanol a 100% e substitua pela solução de infiltração plástica. Coloque os tubos a quatro graus Celsius em um rotador e permita que a infiltração prossiga por cerca de 30 minutos, até que as larvas afundem até o fundo do tubo. Para embutir as larvas, posicione a bandeja de moldagem plástica sob um microscópio estereoscópico.

Transfira as larvas junto com solução de infiltração suficiente para cobri-las para dentro dos copos. O meio de inclusão plástico é preparado em um pequeno tubo de plástico. Normalmente incluímos quatro a cinco larvas por vez, utilizando uma larva para cada copo, e preparamos cinco mililitros de plástico de inclusão.

Adicione 35 microlitros de JB quatro, solução de inclusão B, para cada mililitro da solução de infiltração, misturando bem por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta de plástico ou pipeta plástica várias vezes para garantir que o JB quatro polimerize adequadamente. Após a preparação de cinco mililitros de plástico de inclusão, remova o plástico de infiltração das amostras redondas com uma pipeta de plástico. Encha o copo com plástico de inclusão; o plástico deve escorrer para fora do copo para garantir uma boa aderência do suporte do bloco ao espécime.

Para detectar túbulos renais de peixe-zebra, as seções transversais são as melhores para esse propósito. As larvas devem ser embutidas verticalmente, com a cabeça para baixo, com a ajuda de um cílio com cabo ou pinça fina.

Posicione periodicamente as larvas verticalmente até que o plástico esteja rígido o suficiente para que elas não saiam de sua posição. Isso leva cerca de 20 a 30 minutos. Em seguida, coloque o suporte duplo EVH sobre os copos e deixe a bandeja a quatro graus Celsius durante a noite até que a polimerização esteja completa.

Coloque a amostra no porta-bloco do micrótomo e ajuste o aquecedor de lâminas a 45 graus Celsius. Despeje água desionizada em um béquer e coloque-o próximo ao micrótomo antes do corte. Certifique-se de que o bloco esteja orientado de forma a obter cortes transversais perfeitos das larvas.

As alavancas de ajuste da orientação da cabeça podem ser giradas e a luz de fundo na posição da amostra. Corte seções espessas através da cabeça. Oriente os blocos de modo que seções equivalentes dos olhos sejam obtidas para cada larva.

Quando as nadadeiras peitorais aparecerem nas seções, é quando os túbulos pronefrídicos começam. A partir desse ponto, corte aproximadamente 32 fatias de seção de 4 mícrons dos blocos. Colete as seções com pinça e deixe-as cair no béquer com água sem tocar a água com a pinça.

A seção se expandirá assim que atingir a superfície da água. Agora você pode coletá-la em uma lâmina. Insira a lâmina na água em um ângulo de 45 graus e aproxime-se da seção com a ajuda de um cílio com cabo, tocando apenas as bordas da seção, incube as lâminas em um aquecedor de lâminas até que estejam completamente secas e visualize as seções utilizando microscopia epifluorescente ou confocal.

Quando realizada corretamente, uma larva injetada aparece como mostrado aqui na imagem superior, com o dextrano amarelo fluorescente de luciferase no sistema vascular das larvas. Se a injeção for muito profunda, como na imagem inferior, o material injetado pode ser visto no saco vitelino ou o coração pode ser perfurado, causando sangramento excessivo. As larvas desenvolveram edema pericárdico como consequência da nefrotoxicidade da gentamicina, conforme observado aqui.

As larvas controle na parte superior não exibem edema pericárdico. No entanto, quando injetadas com gentamicina, 80% das larvas de peixe-zebra exibem edema moderado ou grave, conforme indicado pelas setas nos painéis central e inferior. Utilizamos um sistema de classificação baseado em fenótipos, no qual larvas com edema moderado apresentam edema pericárdico evidente, mas nenhum outro fenótipo observável.

Enquanto larvas gravemente edemaciadas apresentam edema pericárdico e do tronco, ausência de circulação no tronco e curvatura acessória leve a moderada utilizando um anticorpo contra túbulos renais direcionado à ATPase de sódio-potássio. Os túbulos danificados são visualizados em cortes transversais com perda evidente da polaridade celular nos painéis C e D e ruptura tubular nos túbulos lesados, em comparação com os controles nos painéis A e B. Este padrão é consistente em múltiplos cortes transversais ao comparar seções. As barbatanas fatoriais e os túbulos contorcidos proximais são utilizados como marcadores anatômicos.

Acabamos de mostrar como induzir lesão renal aguda em peixes-zebra larvais. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar agulhas de injeção com diâmetro entre 10 e 20 micrômetros. Pode ser necessário polir com chama algumas pipetas de retenção para obter os tamanhos adequados, mas, uma vez obtida uma adequada, você pode simplesmente mantê-la, pois ela pode durar por várias sessões de injeção.

Além disso, é importante garantir que não haja bolhas de ar no aparelho micro série JA, pois isso reduziria a posição do sistema. Por fim, posicione o peixe verticalmente durante a inclusão, a fim de obter uma seção transversal perfeita do túbulo renal. É isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.