Name: Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a gerar C. elegans transgênicos por biobalística com partículas de ouro revestidas com DNA. Este método eficiente facilita estudos de regulação gênica por fatores de transcrição em neurociência.

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Este trabalho foi financiado por fundos de sementes da Universidade de Pittsburgh e conceder NIH AG028977 para ALF

Visão global Worms tradicionalmente transgênicos foram gerados por microinjecting DNA transgene no C. elegans germline 1,2,3,4. Embora bem-sucedida, esta abordagem necessários equipamentos especializados eo desenvolvimento de experiência com a anatomia verme e da técnica de microinjeção. Mais recentemente bombardeio biobalística foi desenvolvido como uma abordagem alternativa que usa partículas de DNA revestido de ouro para introduzir DNA estranho no 5,6 germinativas. Essa abordagem requer menos investimento de tempo em termos de prática para se tornar bem sucedido. O bombardeio de biobalística C. elegans para gerar worms transgênico tem baixa eficiência ao nível do worm individuais para o sucesso requer uma grande quantidade de animais. Estes podem ser cultivadas em várias maneiras, mas nós usamos placas de ovos para reduzir o trabalho eo número de placas envolvidas. Nosso protocolo começa com a preparação de placas de ovos e vermes e, em seguida, centra-se no protocolo de bombardeamento utilizando o Bio-Rad PDS-1000/He Sistema Hepta. Nós adaptamos nosso protocolo, em parte, obra de Berezikov et al 7. Com o bombardeio, o gene unc-119 é normalmente usado como um marcador para animais transgênicos. Worm cepas carregando essa mutação são severamente descoordenado e pouco movimento, são dumpy na aparência, e são incapazes de formar Dauer larvas 8. A Dauer é uma fase larval alternativo que é usado para retardar o desenvolvimento de um adulto reprodutivo em condições adversas, ea entrada em Dauer é regulada por múltiplos genes 9. Várias linhagens com o gene unc-119 estão disponíveis no C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). A cepa DP38 original (unc-119 (ED3)) também traz uma formação constitutiva Dauer-independentes (daf-c) mutação que poderia afetar experimentos a jusante. Vários laboratórios têm outcrossed esta mutação, ea tensão HT1593 está disponível a partir da CGC. Descobrimos que os animais transgênicos são um pouco mais fácil de identificar com a cepa DP38 e tendem a utilizar esta cepa para a criação de animais transgênicos. Quando necessário, usamos HT1593 para outcross os vermes transgênicos para remover a mutação daf-c. Obtendo o DP38 worms para crescer é um dos passos mais lentos no protocolo para que manter um estoque de placas de crescimento durante a preparação do transgenes. Expressão do marcador unc-119 junto com o gene de interesse permite a fácil identificação dos animais expressando o transgene com base no resgate da motilidade normal e tamanho do corpo 5. O gene unc-119 pode ser obtido de diversas fontes, e vetores utilizando o DNA genômico unc-119, unc-119 promotor e cDNA e DNA genômico para o menor C. briggsiae gene são utilizados 8,10. Recentemente, descreveu um protocolo simples para adicionar um cassete unc-119 a qualquer plasmídeo contendo um gene de resistência a ampicilina por recombinação homóloga 11 e um método para modificar fosmids worm para transportar o gene unc-119 por Cre-lox recombinação para gerar animais transgênicos 12. Os plasmídeos estão disponíveis a partir Addgene Inc. (Cambridge, MA). Enquanto o esforço envolvido na realização de um bombardeio único é significativo, mas controlável, o trabalho adicional envolvido na realização de bombardeios múltiplas em um único dia é mínima. Consequentemente, nós rotineiramente agrupar a produção de transgênicos worms para diminuir o trabalho envolvido na geração de cada um. 1. Ovo Preparação Placa Os vermes unc-119 mutantes são difíceis de crescer em placas NGM padrão, pois com sua mobilidade prejudicada eles tendem a morrer de fome em partes de um prato, enquanto outras partes da placa ainda contêm alimentos. Placas de ovos resolver este problema como a camada espessa de alimentos em pratos de ovos permite unc-119 vermes a rastejar mais facilmente e para assumir todas as placas do 7. As placas de ovos também têm a vantagem de suportar o crescimento de um grande número de worms para placas que são necessários menos 13. Geralmente 5 placas de ovo são suficientes para crescer worms para um bombardeio. A receita abaixo faz cerca de 50 pratos, mas pode ser reduzido pela metade para fazer menos, se desejar. As placas de ovos pode tornar-se facilmente contaminada por isso usamos os antibióticos e antifúngicos nas placas e só usar ovos gerados pelo tratamento de hipoclorito para semear as placas. Dia 1: <ol><li> Prepare LB (400 mL) em um frasco de 500ml. Autoclave por 20min. </li><li> Despeje ~ 50 centímetros 10 placas NGA usando um litro NGA com agar 2%. Nós adicionamos 10 mL nistatina por litro e estreptomicina a 200 mcg / mL 13. </li><li> Crescer uma cultura de 40 ml durante a noite de OP50-1 em LB com 200 estreptomicina mcg / mL. Esta estirpe é resistente à estreptomicina e disponível a partir de CGC. </li><li> Autoclave uma garrafa de 500mL dedia seguinte. </li></ol> Dia 2: <ol><li> Separe as gemas de 10 ovos de galinha para o frasco estéril. Usamos um separador de gema (disponível em lojas da família, incluindo Target). Shake. </li><li> Traga volume para 400mL com LB. Agitar </li><li> Incubar a 60 ° C por 1 hora. </li><li> Arrefecer à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 40mL de OP50-1. Agitar </li><li> Distribuir 5-8 mL de mistura por placa. </li><li> Permitir que as placas para resolver em temperatura ambiente durante a noite. </li></ol> Dia 3: <ol><li> Gentilmente despeje o líquido restante das placas. Deixe secar com tampas em temperatura ambiente durante a noite. </li></ol> Dia 4: <ol><li> Colocar placas em uma caixa ou saco plástico e armazenar a 4 ° C até ser necessário. Essas placas parecem ser OK para usar por 1-2 meses. </li></ol> 2. Semeadura Placas Egg <ol><li> Expandir o DP38 worms em 6 centímetros placas NGA adicionando OP50 concentrado para placas recentemente fome. Para um único bombardeio, usamos ~ 6 pratos pequenos para placas de semente cinco ovos. Para vários bombardeios, usamos as placas menores ao invés de sementes enriquecidas 2 placas de peptona antes da semeadura as placas de ovo. </li><li> Isolar os ovos do DP38 worms através do uso de hipoclorito de 13,14. Ressuspender os ovos estéreis em buffers S-basal ou M9 13,14. </li><li> Adicione os ovos (&gt; 10 mil por placa) para o número apropriado de placas de ovo. Crescem os vermes em pratos de ovos a 20 ° C por 7-10 dias para uso de bombardeio. As placas estarão prontos para usar uma vez que os vermes começaram a limpar a comida do prato. Essas placas são realmente difíceis de morrer de fome e crescente por períodos mais longos irá melhorar o rendimento worm. </li></ol> Bombardeamento Nós preparamos o estoque de ouro antes do tempo e mantê-lo conservado a 4 ° C para o uso. Também são necessários imaculado e viu 10 placas NGA centímetros. As placas sem mancha precisa ser derramado com bastante antecedência e permitiu a secar completamente para facilitar a absorção do líquido adicionado com os vermes. No dia do bombardeio, que lave os vermes primeiro e depois começar a preparar o DNA revestido por partículas de ouro. Em seguida, adicione os vermes para as placas NGA imaculada e terminar de lavar as partículas de ouro e transferi-las para o macrocarriers. Preparação de partículas de ouro: <ol><li> Pesar 60 mg de partículas de ouro em um tubo de 1.7mL e mergulhar em etanol 70% por 15min. Girar rapidamente a se precipitar as partículas de ouro. </li><li> Lavar 3 vezes em água estéril e girar rapidamente a cada vez para coletar o ouro. </li><li> Ressuspender o ouro em 1mL de glicerol 50% estéril. Esta é a solução de reserva de partículas de ouro e pode ser armazenado durante meses a 4 ° C. </li></ol> Worms: <ol><li> Flutuar o DP38 worms fora do prato de ovos com tampão de S-basal ou M9 e transferi-los para um tubo de 50 ml cônico. </li><li> Manter os tubos no banco até que os vermes estão na parte inferior. Em seguida, aspire o buffer e adicionar novos S-basal ou M9. Lave 2 ou 3 vezes, até encher o buffer é relativamente livre de detritos. Manter os worms nesta etapa até que o revestimento DNA está concluída. </li><li> Aspirar e deixar cerca de 2-3 mL de vermes em tampão por bombardeio. Transfira para uma placa de 10 centímetros NGA imaculada no gelo. É importante minimizar o volume transferido como a placa NGA será necessário secar completamente antes de bombardeio. Certifique-se de cobrir toda a superfície da placa com os vermes. </li><li> Permitir que a placa para secar no gelo. O gelo irá evitar os vermes se aglomerem durante a secagem. </li></ol> Este passo é importante: a placa deve estar seca e as minhocas uniformemente dispersas na placa NGA. Mantendo o worms no gelo impede de mover-se sobre a placa e agregando em pilhas. DNA de preparação (por um bombardeio): <ol><li> Misture em um tubo de 1.7mL: <ul><li> 50μl partículas de ouro. Ressuspender completamente antes de adicionar. </li><li> 50μl de DNA (10-15ug). Vemos pouca diferença entre DNA circular ou linear. Normalmente usamos cartuchos Qiagen midiprep para a purificação de DNA (Qiagen Inc., Valencia, CA). </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. Esta solução é estável por várias semanas em temperatura ambiente. </li><li> 20μl espermidina 0,1 M. A espermidina é instável em solução aquosa. Fazemos alíquotas espermidina 70μl e armazenar a -20 ° C. Em seguida, adicionar 1 ml de água bem antes de usar para obter uma solução 0,1 M. Esta solução deve ser renovada a cada bombardeio. Nós geralmente vortex as partículas de ouro em um tubo 1.7mL a uma velocidade baixa e adicione o CaCl 2, DNA e espermidina / gotas de protamina, enquanto vórtex. Para as pessoas que têm transfectadas com fosfato de cálcio esta técnica é familiar. Temos também utilizado protamina em vez de espermidina com muito bons resultados 15. Nós preparamos uma nova solução (1mg/ml) em água e nose 50μl em vez do 20μl de espermidina. Se usarmos de protamina, que geralmente incubar a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos em vez de colocar no gelo. Protamina não precisam ser mantidos congelados e é um pó em vez de um líquido. </li></ul></li><li> Incubar a mistura em gelo por 30min, e periodicamente mix para manter as partículas de ouro em suspensão. Em seguida, girar rapidamente e aspirar o sobrenadante. </li><li> Lavar com etanol 300 ul de 70%. Girar por alguns instantes. </li><li> Lavar com etanol a 100% 1mL. Girar por alguns instantes. </li><li> Ressuspender em 170μl de etanol 100%. </li></ol> Preparação de macrocarriers: <ol><li> Enxágüe 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), em 2-propanol. Coloque-os sobre papel absorvente e deixe-os secar em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 20μl de DNA / ouro mistura no centro de cada macrocarrier. Certifique-se de direito vortex antes de pipetar para manter o ouro em suspensão. </li><li> Deixe o álcool evaporar. </li></ol> 3. Bombardeamento Certifique-se de realizar um bombardeio em branco antes do experimento para lavar hélio através do sistema. <ol><li> Ligue a bomba de vácuo e trap bomba perto de vácuo. Nós usamos uma bomba de vácuo oil-free. </li><li> Ligue tanque de hélio. Verifique que a pressão é ≥ 2200psi. </li><li> Disco de ruptura Wet (1350 psi) em 2-propanol, colocando na retenção de tampa para hepta adaptador. </li><li> Parafuso adaptador no PDS-1000 do sistema e aperte com a chave de torque fornecido. </li><li> Coloque o 7 macrocarriers no suporte e encaixá-los com a ferramenta fornecida. Em seguida, coloque uma tela de parar hepta e no fundo para o titular. Virar o suporte e coloque na segunda prateleira de cima. O ouro manchado lado do macrocarriers deve estar voltado para baixo neste momento. </li><li> Alinhe os orifícios no topo do titular macrocarrier com as saídas do adaptador hepta. </li><li> Coloque a placa NGA revestido com worms (off tampa) na prateleira mais baixa na câmara de bombardeio. </li><li> Abra completamente a vácuo botão vazão no PDS-1000. Pressione o botão até vac câmara atinge 26 Em Hg. Em seguida, mudar para manter a posição de manter o vácuo. </li><li> Pressione e segure o botão de tiro até rupturas disco. Isso acontecerá quando a pressão chega a 1350psi. Às vezes, isso leva 50-20 segundos para ocorrer. Solte o botão. </li><li> Lançamento da câmara de vácuo (posição de ventilação), e remover placa. </li><li> Por sua vez vácuo e off hélio. </li><li> Fogo várias vezes até que a linha não contém hélio (medidor de hélio deve marcar 0 psi). </li><li> Desligue o sistema PDS-1000. </li></ol> Worm recuperação depois do bombardeamento: <ol><li> Deixe a placa bombardeado a 20 ° C por 20 minutos. </li><li> Float os vermes da placa com 10 mL de tampão S-basal ou M9. </li><li> Coloque worms 0,5 ml em 20 - 10 cm placas NGA manchado. </li><li> Deixe a 20 ° C de temperatura ou quarto (22-24 ° C) por cerca de duas semanas antes de verificar para worms resgatados. </li><li> Tela para worms com o fenótipo unc-119 (+) com um microscópio de dissecação. O tempo ideal para a triagem é após as placas de ter passado fome desde o worms resgatados ter vantagem de sobrevivência sobre os não-resgatada worms. </li><li> Gerar uma linha individual de cada placa de 10 cm que continha worms resgatados. </li></ol> 4. Resultados representante O sucesso do protocolo no que diz respeito à obtenção de animais transgênicos depende do transgene particular. Para promotor: transgenes repórter GFP obtivemos até 20 linhas. Um resultado mais comum é 30-10 linhas. Até 30% das linhagens transgênicas são linhas integradas, mas esta é aleatória e vamos realizar bombardeios múltiplas em um único dia, se uma linha integrada é particularmente desejado.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Bombardeio biobalística é um método simples para introduzir DNA estranho para muitos organismos, incluindo C. elegans 1,5,6,7,16. Ele se baseia partículas de ouro formando um complexo com o DNA na presença de CaCl 2. Poliaminas catiônicas, tais como a espermidina, proteger o DNA de nuclease degradação in vivo. Desde espermidina é uma molécula instável, é importante para armazená-lo em pequenas alíquotas a -20 ° C, e fazer a solução certa antes de realizar o bombardeio. Como descrevemos no ...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>Partículas de ouro</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1micron</td></tr><tr><td>Kit para midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>Protamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Macroportadores</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Sistema PDS-1000/He Hepta</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Disco de ruptura</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin </td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de transgênicos c. elegans por biobalística transformação

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

O número de laboratórios usando o C. nematóide de vida livre elegans está crescendo rapidamente. A popularidade deste modelo biológico é atribuído a um tempo de geração rápido e vida curta, manutenção fácil e barata, o genoma completamente seqüenciado, e matriz de RNAi recursos e animais mutantes. Além disso, a análise do C. elegans genoma revelou uma grande semelhança entre worms e vertebrados superiores, o que sugere que a pesquisa em vermes pode ser um complemento importante para os estudos realizados em ratos inteiros ou células em cultura. Uma parte poderosa e importante de pesquisa worm é a capacidade de usar animais transgênicos para estudar a localização ea função do gene. Animais transgênicos podem ser criadas através de microinjeção da linha germinativa worm ou através do uso de bombardeio biobalística. Bombardeio é uma nova técnica e é menos familiar para uma série de laboratórios. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para gerar worms transgênicas por biobalística bombardeio com partículas de ouro usando o Bio-Rad PDS-1000 do sistema. Em comparação com a microinjeção de DNA em células germinativas hermafroditas, este protocolo tem a vantagem de não exigir habilidades especiais do operador com relação à identificação de anatomia worm ou realizar microinjeção. Além disso várias linhagens transgênicas são normalmente obtidos a partir de um único bombardeio. Também em contraste com a microinjeção, bombardeio biobalística produz animais transgênicos com ambos os arrays e extracromossómicos transgenes integrados. A capacidade de obter linhagens transgênicas integrada pode evitar o uso de protocolos mutagênico para integrar DNA estranho. Em conclusão, o bombardeio biobalística pode ser um método atrativo para a geração de animais transgênicos, especialmente para os pesquisadores não estão interessados ​​em investir o tempo eo esforço necessário para se tornar hábil em microinjeção.

Worms transgênicos são comumente usados ​​em<em&gt; C. elegans</em&gt; Pesquisa. Descrito é um protocolo simples, mas eficaz, para introduzir transgenes em vermes usando biobalística bombardeio com partículas de DNA revestido de ouro. O esforço envolvido e os resultados do bombardeio comparam favoravelmente com microinjeção para a geração de animais transgênicos.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

O número de laboratórios que utilizam o nemátodo de vida livre C. elegans está crescendo rapidamente. A popularidade deste modelo biológico é atribuída a um rápido...

O objetivo geral deste procedimento é gerar vermes transgênicos por meio de transfeção biótica ou com canhão de genes. Primeiro, grandes quantidades de vermes são cultivadas, depois partículas de ouro são revestidas com DNA, e os vermes são bombardeados; em seguida, a prole transgênica é isolada e recuperada, e novas linhagens transgênicas são estabelecidas. Olá, sou Daniel Owa do laboratório do Dr. Alfred Fisher do Departamento de Medicina da Universidade de Pittsburgh.Hoje vamos mostrar um procedimento para gerar vermes transgênicos. Utilizamos este procedimento para estudar a regulação gênica por fatores de transcrição. Então, vamos começar.A preparação da placa de ovos começa derramando uma mistura de 2% de ágar em meio NGA suplementado com nistatina e estreptomicina. Em placas de 10 a 50 centímetros, deixe as placas secarem à temperatura ambiente. Em seguida, autoclave 400 mililitros de meio LB em uma garrafa de 500 mililitros e 40 mililitros de meio LB em um frasco de 250 mililitros.Também esterilize em autoclave um frasco vazio de 500 mililitros por 20 minutos. Após a autoclavação, adicione estreptomicina ao meio LB de 40 mililitros até uma concentração final de 200 microgramas por mililitro. Em seguida, inocular com a linhagem de e coli.OP 50 dash um. Incube a cultura durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, coloque as gemas de 10 ovos de galinha no frasco estéril de 500 mililitros.Complete o volume até 400 mililitros com meio LB e agite para formar uma solução uniforme. Incube a solução a 60 graus Celsius por uma hora. Depois que a mistura yo lb atingir a temperatura ambiente, adicione os 40 mililitros de cultura ELI ao frasco e agite.Em seguida, pipete de cinco a oito mililitros da cultura nas placas de NGA preparadas. Deixe secar durante a noite à temperatura ambiente no dia seguinte. Descarte qualquer líquido remanescente e seque por mais uma noite à temperatura ambiente.Neste momento, as placas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por um a dois meses ou semeadas imediatamente com vermes. Para expandir uma população DP 38 CL novamente, adicione uma cultura concentrada de E. coli OP50 em placas NGA de seis centímetros contendo vermes DP 38 recentemente privados de alimento e incube. Utilize solução alcalina de hipoclorito para isolar os ovos dos vermes DP 38.O procedimento é descrito no protocolo acompanhante. Uma vez que os ovos tenham sido isolados, ressuspenda-os em tampão s basil ou M nine. Adicione mais de 10.000 ovos a cada placa de ovos de 10 centímetros preparada e permita que os vermes cresçam a 20 graus Celsius por sete a dez dias.Uma vez que as minhocas tenham começado a limpar o alimento, as placas estão prontas para serem bombardeadas. Para revestir partículas de ouro com DNA para o bombardeio, adicione 60 miligramas de partículas de ouro a um tubo de 1,7 mililitro. Em seguida, adicione etanol 70% e deixe as partículas de ouro embebidas por 15 minutos.Centrifugue o tubo brevemente para pelotar as partículas de ouro. Decante o etanol. Em seguida, lave as partículas de ouro três vezes com água estéril.Resuspenda o ouro em um mililitro de glicerol estéril a 50%. A solução estoque de partículas de ouro pode ser armazenada por meses a quatro graus Celsius. Em seguida, colete os vermes fazendo-os flutuar a partir das placas de ovos usando tampões s basil ou M line.Em seguida, transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros. Deixe os vermes sedimentarem no fundo do tubo. Em seguida, aspire todo o tampão, exceto dois a três mililitros, utilizando o tampão restante.Transfira os vermes para uma placa NGA de 10 centímetros sem manchas que tenha sido colocada sobre gelo de forma uniforme. Distribua os vermes por toda a placa. Em seguida, deixe a placa secar completamente sobre gelo.Isso evitará que os vermes se aglomerem durante o processo de secagem. É importante que os vermes estejam distribuídos uniformemente e que a placa esteja completamente seca antes do procedimento de bombardeio. Para preparar as partículas de ouro revestidas com DNA, adicione 50 microlitros das partículas de ouro em suspensão a um tubo de 1,7 mililitro.Centrifugue os part&iacute;culas de ouro e remova o sobrenadante. Em seguida, adicione uma mistura de 10 a 15 microgramas de DNA de interesse purificado, circular ou linearizado, e 20 microlitros de espermamina 0,1 molar rec&eacute;m-preparada. Por fim, enquanto v&oacute;rtexa suavemente o tubo, adicione 50 microlitros de cloreto de c&aacute;lcio 2,5 molar e incube a mistura em gelo por 30 minutos com mistura peri&oacute;dica para manter as part&iacute;culas de ouro em suspens&atilde;o.Após 30 minutos, centrifugue a mistura de partículas de ouro. Aspire brevemente o sobrenadante e lave com 300 microlitros de etanol 70%, seguido por um mililitro de etanol 100%; finalmente, re-suspenda as partículas de ouro revestidas com DNA em 170 microlitros de etanol 100%. Para cada bombardeio, enxágue sete macroportadores, que conterão as partículas de ouro, em dois propanol e, em seguida, deixe-os secar à temperatura ambiente.Vortex a mistura de DNA e ouro. Em seguida, pipete 20 microlitros no centro de cada transportador macro. Deixe o etanol evaporar.Insira o disco de ruptura no adaptador Hector e fixe o adaptador no aparelho de bombardeamento. Em seguida, coloque os sete macroportadores no suporte e use a ferramenta fornecida para acomodá-los. A seguir, coloque uma tela de parada Hector e a base sobre o suporte.Coloque o suporte de cabeça para baixo, de modo que o lado com pontos dourados dos macroportadores fique virado para baixo. Em seguida, posicione-o na segunda prateleira a partir do topo. Alinhe os orifícios na parte superior do suporte dos macroportadores com as saídas do adaptador Hector.Remova a tampa da placa de NGA revestida com vermes e coloque-a na prateleira inferior da câmara de bombardeamento. Abra completamente o botão de vazão do vácuo e pressione e segure o botão de vácuo até que a câmara atinja 26 polegadas de mercúrio. Em seguida, mude para a posição de retenção para manter o vácuo e pressione e segure o botão de disparo até que o disco se rompa.Isso ocorrerá quando a pressão atingir 1.350 PSI e pode levar de cinco a 20 segundos. Solte o botão, libere o vácuo da câmara alternando para a posição de ventilação e remova a placa. Desligue o vácuo no hélio.Em seguida, pressione disparar várias vezes até que a linha de hélio esteja clara e o manômetro de hélio indique zero PSI; finalmente, desligue o sistema PDS 1000. Agora que os vermes foram transformados, eles podem ser recuperados e incubados após a bombardeação.Coloque a placa a 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, retire os vermes da placa com 10 mililitros de tampão S basil ou M nine, inoculando placas NGA de 2010 centímetros com 0,5 mililitros dos vermes em tampão. Deixe as placas à temperatura ambiente por aproximadamente duas semanas.Realize uma triagem para verificar a recuperação do fenótipo UNC one 19 pelo transgene e gere uma linhagem individual a partir de cada placa de 10 centímetros que contenha os vermes recuperados. O sucesso do protocolo com relação à obtenção de animais transgênicos depende do transgene específico. Para transgenes repórter GFP com promotor, obtivemos até 20 linhagens.Um resultado mais típico é de três a dez linhagens. Até 30% das linhagens transgênicas são linhagens integradas, mas isso é aleatório e realizaremos múltiplos bombardeios em um único dia se uma linhagem integrada for particularmente desejada. É mostrado um exemplo representativo de placa de 10 centímetros contendo um mutante 19 com os vermes resgatados por bombardeio com transgene.Os vermes resgatados podem ser identificados pelo tamanho maior e mobilidade muito melhorada em relação aos não transformados. Em um dos 19 mutantes, o isolamento de vermes resgatados transformados com um transgene GFP distante resulta na expressão de GFP.Este transgene expressa GFP fortemente no intestino e na hipoderme de vermes transgênicos. Esse transgene específico está integrado no cromossomo do verme, e 100% da prole expressa o transgene. Acabamos de mostrar como realizar a bombardeio bio holístico de sea elegance ao executar este procedimento.É importante cultivar muitos vermes e usar meio fresco. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

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