Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

A expressão de repórteres fluorescentes em animais transgênicos possibilita acompanhar as respostas celulares a manipulações experimentais em modelos vivos de doenças. Aqui, a perda seletiva de células é induzida farmacologicamente em peixes-zebra, confocais multicoloridos de alta resolução. As imagens das células-alvo e vizinhos imediatos são adquiridas antes ou imediatamente depois, e seus intervalos espaçados após a análise de imagens de tratamento medicamentoso demonstram a ativação de populações de células-tronco endógenas e subsequente substituição de células-alvo durante a fase de recuperação.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia regenerada, como Quais são os mecanismos celulares e moleculares usados para regenerar tipos de células discretas Comece transferindo óvulos transgênicos coletados de acasalamentos para uma placa de Petri contendo 0,3 x solução de danio 16 horas após a fertilização. ADICIONE PTU para inibir a atividade da tirosina ECA antes de qualquer evidência de pigmentação no tecido de interesse. Se o embrião não for albino, incube os embriões a 28,5 graus Celsius.

Assim que os repórteres estiverem evidentes, coloque a placa de Petri sob um microscópio de zoom estéreo fluorescente e classifique a expressão do transgene desejada. Antes da imagem. Prepare uma solução de montagem aeros de baixo ponto de fusão a 0,5% em meio embrionário e armazene-a a 40 graus Celsius.

Adicione trica e PTU, se necessário. Misture delicadamente e volte a 40 graus Celsius. Anestesiar os peixes colocando-os em meio embrionário contendo trica.

Por aproximadamente três minutos, o peixe não responderá. Para tocar usando uma micropipeta, puxe os peixes individuais para uma ponta de pipeta aparada em um volume de aproximadamente 30 microlitros de solução anestésica. Em seguida, inverta a pipeta e deixe o peixe assentar no fundo.

Toque a ponta na solução de montagem e deixe-os transferir por gravidade. Tome cuidado para não diluir o agro para que possa ser reutilizado. Descarte a solução anestésica restante da micropipeta.

Em seguida, usando a mesma ponta, transfira o peixe para uma placa de Petri. Em cerca de 30 microlitros de solução de montagem, oriente suavemente o peixe de forma que a região de interesse fique centralizada na gota aeros. Certifique-se de que os peixes permaneçam na orientação desejada até que o aeros se solidifique.

Vários peixes podem ser montados em uma única placa de Petri, se desejado. Depois que o aeros se solidificar, transporte o peixe para o estágio de microscópio confocal e adicione suavemente meio embrião contendo trica mais ou menos PTU ao prato até que os peixes estejam completamente submersos. Abra o software de imagem e concentre-se na região de interesse para obter imagens ideais de detalhes celulares e/ou moleculares.

Use objetivas de longa distância de trabalho com altas aberturas numéricas no software. Escolha os quatro de flora apropriados na lista de discagem. Clique na configuração espectral e faça ajustes nas faixas de emissão.

Para obter uma separação limpa dos sinais do repórter e maximizar as relações sinal-ruído. Selecione o objetivo apropriado no menu suspenso para garantir que todas as predefinições definidas pelo software sejam ajustadas corretamente. Para focar os lasers e definir os níveis de potência, selecione uma saída na tabela de pesquisa que revele a saturação de pixels para cada canal.

Em seguida, defina a sensibilidade do detector para obter a qualidade de imagem desejada, aumente gradualmente a saída do laser até que a intensidade da imagem seja aceitável. Evite a saturação de pixels na região de interesse e mantenha os níveis de laser o mais baixo possível. Para reduzir problemas de fotobranqueamento e fototoxicidade.

Certifique-se de que cada linha de laser produza sinal detectável apenas no canal apropriado, ligando e desligando manualmente os lasers enquanto monitora todos os canais de imagem. Se nenhuma diafonia for evidente, todos os canais podem ser adquiridos simultaneamente. Em seguida, enquadre a área de interesse usando as funções de zoom e rotação.

Em seguida, defina a velocidade de digitalização e o tamanho da imagem usando velocidades de digitalização mais rápidas, minimiza o tempo de permanência do laser e aumenta a resolução temporal. Defina o tamanho da etapa da dimensão Z de acordo com as necessidades experimentais. Aqui, um tamanho de passo de 10 mícrons é usado para obter imagens de sete seções ópticas do tecido da retina.

Depois que as configurações apropriadas forem determinadas, adquira as imagens do Zack e salve. Em seguida, passe para o próximo peixe. Imagens seriadas de captura e liberação podem ser realizadas para rastrear alterações celulares em dias sucessivos, de acordo com as instruções no documento escrito que o acompanha.

Ao realizar um experimento de imagem com vários repórteres, é melhor usar pisos bem separados, espectrais, no entanto, isso nem sempre é prático. Aqui mostramos um método simples de subtração de imagem usando o software de código aberto image J para separar pisos com perfis de excitação e emissão sobrepostos. No nosso caso, GFP e YFP.

As técnicas de imagem de linhas do tempo descritas neste vídeo foram usadas para monitorar células-tronco retinianas marcadas com GFP durante a ablação e regeneração de neurônios bipolares da retina Para realizar a separação espectral, colete imagens usando modos de imagem sequenciais e configurações de filtro de barreira variável, que permitem que os quatro andares sobrepostos sejam adquiridos de forma independente e parcialmente separados, respectivamente. Depois que as imagens forem adquiridas, use a importação de bioformas do ImageJ loci para abrir os arquivos de imagem para iniciar a ferramenta de importação. Arraste o arquivo de interesse para a janela J da imagem.

Divida os canais em pilhas individuais usando a caixa de seleção dividir canais na janela de importação para iniciar o plug-in align three TP. Clique em plug-ins e alinhe as pilhas. Em seguida, alinhe três tp.

As pilhas devem ser alinhadas para garantir a subtração adequada. Selecione a pilha de referência na primeira caixa suspensa e a pilha desalinhada na segunda. Marque as caixas usar origem relativa XY e usar origem relativa Z e clique em OK.

Para iniciar o processo de alinhamento, clique no botão de registro de volume. Uma nova janela aparecerá contendo os parâmetros de alinhamento. Clique em OK.

Esta seção foi otimizada pelo distribuidor do plugin, portanto, nenhuma modificação é necessária. Quando terminar, uma janela de pilhas alinhadas aparecerá. Selecione a saída na janela alinhada para abrir a janela de saída.

Essa janela também é otimizada e não precisa de modificação. Clique em OK. Uma nova pilha aparecerá no espaço de trabalho com alinhado anexado ao final do título do arquivo.

Para remover diafonia usando a calculadora de imagens, clique em processar e depois em calculadora de imagens. Selecione a pilha a ser subtraída na caixa suspensa da imagem e a pilha a ser usada na subtração. Na caixa suspensa da imagem dois, selecione subtrair na caixa suspensa da operação e clique em OK.

A imagem J solicitará o processamento da pilha. Selecione sim. Uma nova pilha deve aparecer, removendo a diafonia entre os canais sobrepostos.

Mescle as pilhas para recriar a mesma estrutura de imagem antes do alinhamento e da subtração. Ao selecionar canais mesclados na janela de ferramentas de canal, a ferramenta permite a fusão de até quatro pilhas em uma hiperpilha. Por fim, colora os canais, ajuste o brilho e o contraste e salve os arquivos como tiffs para examinar a perda e a regeneração direcionadas da nitro redutase.

M cherry expressando células bipolares da retina. Uma série temporal de imagens confocais foi tirada em peixes-zebra individuais antes do tratamento. Há expressão em mosaico de repórter YFP marcado com membrana em células bipolares controladas mostradas em amarelo e proteína de fusão de cereja nitro redutase em bipolares direcionados mostrados em vermelho.

O transgene CFP marcado com membrana mostrado em ciano fornece informações contextuais sobre a maioria das outras células da retina para maior clareza. A mesma imagem sem o sinal CFP é mostrada após o tratamento com metronidazol. As células bipolares que expressam nitro redutase vermelha são perdidas, enquanto as células bipolares controladas amarelas são poupadas.

Isso demonstra a natureza altamente específica dessa metodologia de ablação. Novamente, a mesma imagem sem CFP é mostrada para maior clareza. Quando o metro NIAZ é removido, as células que expressam NTR retornam aqui.

Um exemplo do método de subtração G-F-P-Y-F-P é mostrado nesta figura GFP rotulado Mueller. As células GL são mostradas em verde e as células bipolares marcadas com YFP são mostradas em roxo. A sobreposição entre os dois produz branco para realizar a subtração.

As imagens GFP e YFP devem primeiro ser alinhadas. O processo de subtração permite que as células bipolares marcadas com YFP sejam removidas da imagem GFP, permitindo que o ggl de Mueller rotulado com GFP seja representado de forma limpa e as células de Mueller mais escuras sejam detectadas. A sobreposição entre as células bipolares marcadas com Mueller, ggl e M cherry mostradas em vermelho agora pode ser verificada.

Os dados mostrados aqui sugerem que a ablação de células bipolares desencadeia o ggl mullar para substituir as células perdidas. Essa interpretação está de acordo com estudos recentes de regeneração da retina, que implicam Mueller Ggl como progenitores induzidos por lesões em mamíferos e peixes. Essa técnica permite que os pesquisadores explorem mecanismos que regulam a regeneração de tipos específicos de células por meio da visualização de células-tronco em peixes-zebra.