Name: Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a realizar imagem multicolor em tempo real e ablação celular direcionada em peixe-zebra transgênico. Este método permite visualizar a ativação de células-tronco da retina e estudar mecanismos de regeneração neural in vivo.

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Queremos agradecer as Dras. Meera Saxena e Jonathan Mathias para a comentários úteis sobre o manuscrito. Agradecemos a drs. Michael Parsons, Pamela Raymond, e Rachel Wong para a prestação de linhagens transgênicas. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela IACUC MCG aprovado protocolo 07-12-003 * B. Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 MH083614 e um March of Dimes O Conner Basil Scholar Award Starter para JSM

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
<li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li>
<li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in%0A++zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in
 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by%0A++confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by
 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

JSM tem sido concedida uma patente sobre o uso do sistema baseado em nitroreductase de ablação de células em zebrafish (Mumm JS, e Schroeter, EH ablação Ablação alvejado e Regional Celular em Zebrafish &quot;Patente dos EUA 7.514.595. 7 de abril de 2009). Esta técnica é usado como a plataforma geral para uma empresa de serviços e ferramentas de biotecnologia, Luminomics, Inc., que JSM fundou e continua a ser uma das partes interessadas dentro

Neste vídeo, uma visão geral das técnicas que usamos para multicolor imagem lapso de tempo confocal e ablação de células alvo é fornecido. Nós empregamos lapso de tempo de imagem para monitorar o comportamento dos vários tipos de células de interesse in vivo, enquanto a ablação de células-alvo é usada para estudar a função do circuito neural e células específicas paradigmas regeneração neuronal. Os exemplos mostrados destacar várias vantagens que pode ser adquirida a partir dessas abordagens. Talvez o mais significativamente, time-lapse imaging fornece um paradigma internamente controlada, qualquer e todos os fenômenos observados podem ser relacionadas de volta ao estado anterior. Isto permite comparações diretas ao invés de inferir a ser feita através de pontos de tempo experimental, fazendo alterações em relação mais fácil de quantificar e reduzir o &#39;ruído&#39; experimental associados a variações dentro de uma população. Uma vantagem de multicolor de imagem é a capacidade de visualizar as mudanças na interação e / ou tipos de células vizinhas. Por exemplo, usando uma linha transgênica que rotula glia Müller, agora estamos caracterizando a resposta destas possíveis células-tronco induzidas por lesão à perda de discretas subpopulações de células da retina. Temos também usado essa abordagem para definir novos mecanismos de formação de circuito neural 2. Finalmente, além de estudos de regeneração celular, que recentemente começaram a utilizar o sistema de ablação baseado NTR para investigar o papel funcional de subtipos neuronais, assim, discreta circuitos neurais utilizando vários paradigmas comportamentais e ensaios eletrofisiológicos. A única vantagem de empregar o zebrafish para esses estudos é que, devido à sua capacidade regenerativa, déficits induzidos são temporários. Assim, através da correlação com os ensaios de lapso de tempo de imagem, podemos caracterizar os mecanismos que levam a reinervação, bem como a extensão da reinervação necessário para a recuperação funcional. Os métodos fornecidos pode ser adaptado a muitas perguntas diferentes. Por exemplo, análises semelhantes de ablação e regeneração pode ser aplicado a qualquer subtipo transgenicamente definível celular. Coletivamente, esses estudos têm potencial para expandir nossa compreensão da regeneração ao nível dos tipos de células individuais e dentro de nichos de células-tronco discreta.

1. Reagentes: Danieau solução é: <ul><li> cloreto de sódio (Fisher, S271 1) </li><li> cloreto de potássio (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> sulfato de magnésio (Fisher, M65 500) </li><li> nitrato de cálcio (Fisher, C109500) </li><li> Penicilina-estreptomicina (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Outros reagentes: <ul><li> Baixo derreta agarose (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane metanossulfonato (Fisher, NC9435281) </li><li> N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Suprimentos: <ul><li> Profunda petri pratos (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 pinças finas (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Equipamento: <ul><li> Stereoscope Zoom (Olympus, SZ51) </li><li> Fluorescência Stereoscope Zoom (Olympus, SZX16) </li><li> Microscópio confocal (Olympus FV1000) </li><li> Digital aquecedor de bloco - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Incubadora de bancada (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor imagem em tempo-lapso de transgênicos zebrafish: visualizando células-tronco da retina ativado por ablação célula-alvo neuronal

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Imagens de alta resolução de lapso de tempo de larvas do peixe vivo pode ser utilizado para visualizar como se desenrolam os processos biológicos (para revisão ver 1). Peixe composto transgênicos que expressam diferentes repórteres fluorescentes em tipos de células vizinhas fornecer um meio de seguir interações celulares 2 e / ou tecido em nível de respostas às manipulações experimentais ao longo do tempo. Neste vídeo, demonstramos métodos que podem ser usados ​​para a imagem latente vários tipos de células em série transgenicamente rotulados em peixes individual sobre cursos de tempo que pode se estender de minutos a vários dias. As técnicas descritas são aplicáveis ​​a qualquer estudo busca correlacionar a &quot;comportamento&quot; de tipos de células vizinhas ao longo do tempo, incluindo: &#39;pesque e solte &quot;um serial) métodos para a imagem de um grande número de peixes ao longo de dias sucessivos, 2) abordagens simplificadas para separar fluoróforos com sobreposição de excitação / emissão de perfis (por exemplo, GFP e YFP), 3) uso de hipopigmentadas linhagens mutantes para estender a janela de tempo disponível para imagens de alta resolução em final de estágios larvais de desenvolvimento, 4) uso da membrana alvo repórteres fluorescentes para revelar detalhes morfológicos multa de células individuais, bem como detalhes de celular em populações maiores de células, e 5) um método descrito anteriormente para quimicamente induzida por ablação de tipos de células transgenicamente alvo, ou seja, nitroreductase (NTR) conversão mediada de substratos pró-fármaco, como metronidazol (MTZ), aos derivados citotóxicos 3,5. Como exemplo dessas abordagens, vamos visualizar a ablação e regeneração de um subtipo de neurônios da retina bipolar dentro de cada peixe durante vários dias. Simultaneamente, vamos monitorar vários outros tipos de células da retina, incluindo células vizinhas não-alvo e potenciais bipolar degeneração estimulado as células-tronco da retina (ou seja, glia Mϋller). Esta estratégia está sendo aplicada em nosso laboratório para caracterizar células e tecidos de nível (por exemplo, nicho de células-tronco) respostas à perda seletiva e regeneração de alvo tipos de células neuronais.

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de interesse<em&gt; In vivo</em&gt;. Ablação de células alvo facilita o estudo da função do circuito neural e células específicas paradigmas regeneração neuronal.

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

A imagem de lapso de tempo (time-lapse) de alta resolução de larvas de peixe-zebra vivas pode ser utilizada para visualizar como os processos biológicos se desenrolam (para revisão, ver 1). O composto ...

A expressão de repórteres fluorescentes em animais transgênicos torna possível acompanhar as respostas celulares a manipulações experimentais em modelos vivos de doenças. Aqui, a perda seletiva de células é induzida farmacologicamente em peixe-zebra, utilizando confocal multicolorido de alta resolução. Imagens das células-alvo e de seus vizinhos imediatos são adquiridas imediatamente antes e após, bem como em intervalos espaçados após o tratamento com fármaco. A análise de imagem demonstra a ativação de populações endógenas de células-tronco e a subsequente substituição das células-alvo durante a fase de recuperação.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da biologia regenerativa, como quais são os mecanismos celulares e moleculares utilizados para regenerar tipos celulares específicos. Comece transferindo ovos transgênicos coletados de cruzamentos para uma placa de Petri contendo solução 0,3 x danio 16 horas após a fertilização. ADICIONE PTU para inibir a atividade da tirosina ACE antes de qualquer evidência de pigmentação no tecido de interesse. Se o embrião não for albino, incube os embriões a 28,5 graus Celsius.Uma vez que os repórteres sejam evidentes, coloque a placa de Petri sob um microscópio estéreo fluorescente com zoom e selecione a expressão do transgene desejada. Antes da aquisição de imagens, prepare uma solução de montagem de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% em meio para embriões e armazene-a a 40 graus Celsius.Adicione trica e PTU, se necessário. Misture suavemente e retorne à temperatura de 40 graus Celsius. Anestesie os peixes colocando-os no meio de embrião contendo trica.Por aproximadamente três minutos, os peixes ficarão sem resposta. Ao tocar com uma micropipeta, aspire peixes individuais para dentro da ponteira recortada, em um volume de aproximadamente 30 microlitros de solução anestésica. Em seguida, inverta a pipeta e permita que os peixes sedimentem no fundo.Toque a ponta à solução de montagem e permita que as amostras se transfiram por gravidade. Tenha cuidado para não diluir a agro, de modo que ela possa ser reutilizada. Descarte a solução anestésica remanescente da micropipeta.Em seguida, utilizando a mesma ponteira, transfira o peixe para uma placa de Petri. Em cerca de 30 microlitros de solução de montagem, posicione suavemente o peixe de modo que a região de interesse fique centralizada na gota de aerossol. Certifique-se de que o peixe permaneça na orientação desejada até que o aerossol solidifique.Vários peixes podem ser montados em uma única placa de Petri, se desejado. Após a solidificação do ágar, transporte os peixes para a platina do microscópio confocal e adicione cuidadosamente meio para embriões contendo trica com ou sem PTU à placa até que os peixes fiquem completamente submersos. Abra o software de aquisição de imagens e foque na região de interesse para obter uma imagem ideal dos detalhes celulares e/ou moleculares.Utilize objetivos de longa distância de trabalho com altas aberturas numéricas no software. Escolha os filtros de fluorescência apropriados na lista de seleção. Clique em configurações espectrais e faça ajustes nas faixas de emissão.Para obter uma separação limpa dos sinais do repórter e maximizar as relações sinal-ruído, selecione a objetiva apropriada no menu suspenso para garantir que todos os ajustes predefinidos pelo software sejam corretamente configurados. Para focalizar os lasers e definir os níveis de potência, selecione uma saída da tabela de consulta que revele a saturação dos pixels para cada canal.Em seguida, ajuste a sensibilidade do detector para obter a qualidade de imagem desejada, aumentando gradualmente a saída do laser até que a intensidade da imagem seja aceitável. Evite a saturação de pixels na região de interesse e mantenha os níveis de laser tão baixos quanto possível. Para reduzir problemas de fotobranqueamento e fototoxicidade.Certifique-se de que cada linha de laser produza sinal detectável apenas no canal apropriado, ligando e desligando manualmente os lasers enquanto monitora todos os canais de imagem. Se não houver evidência de interferência cruzada, todos os canais podem ser adquiridos simultaneamente. Em seguida, delimite a área de interesse utilizando as funções de zoom e rotação.Em seguida, defina a velocidade de varredura e o tamanho da imagem; usar velocidades de varredura mais rápidas minimiza o tempo de permanência do laser e aumenta a resolução temporal. Ajuste o tamanho do passo na dimensão Z de acordo com as necessidades experimentais. Aqui, um tamanho de passo de 10 mícrons é utilizado para imagens de sete seções ópticas de tecido retiniano.Uma vez que as configurações apropriadas tenham sido determinadas, adquira as imagens de Zack e salve-as. Em seguida, passe para o próximo peixe. A imagem com captura e liberação em série pode ser realizada para acompanhar alterações celulares ao longo de dias sucessivos, conforme as instruções no documento escrito acompanhante.Ao realizar um experimento de imagem com múltiplos marcadores, é preferível usar fluoróforos que estejam bem separados espectralmente; entretanto, isso nem sempre é prático. Aqui, demonstramos um método simples de subtração de imagens utilizando o software livre ImageJ para separar fluoróforos com perfis de excitação e emissão sobrepostos. No nosso caso, GFP e YFP.As técnicas de imagem em linhas do tempo descritas neste vídeo foram utilizadas para monitorar células-tronco retinianas marcadas com GFP durante a ablação e regeneração de neurônios bipolares da retina. Para realizar a separação espectral, colete imagens utilizando modos de aquisição sequencial e configurações variáveis de filtros de bloqueio, o que permite que fluorescências sobrepostas sejam adquiridas de forma independente e separadas parcialmente, respectivamente. Após a aquisição das imagens, utilize a importação loci bio formas do ImageJ para abrir os arquivos de imagem e iniciar a ferramenta de importação. Arraste o arquivo de interesse para a janela do ImageJ.Divida os canais em pilhas individuais usando a caixa de seleção dividir canais na janela de importação para iniciar o plugin alinhar três TP. Clique em plugins, depois em alinhar pilhas. Em seguida, alinhe três tp.As pilhas devem ser alinhadas para garantir a subtração adequada. Selecione a pilha de referência na primeira caixa suspensa e a pilha desalinhada na segunda. Marque as opções usar origem relativa XY e usar origem relativa Z e clique em ok.Para iniciar o processo de alinhamento, clique no botão de registro de volume. Uma nova janela aparecerá contendo os parâmetros de alinhamento. Clique em OK.Esta seção foi otimizada pelo distribuidor do plugin, portanto nenhuma modificação é necessária. Ao finalizar, uma janela de pilhas alinhadas aparecerá. Selecione a saída na janela alinhada para abrir a janela de saída.Esta janela também é otimizada e não necessita de modificações. Clique em OK. Uma nova pilha aparecerá na área de trabalho com "alinhado" acrescentado ao final do título do arquivo.Para remover a interferência cruzada usando a calculadora de imagens, clique em processar e depois em calculadora de imagens. Selecione na caixa suspensa da imagem um a pilha que será subtraída e a pilha a ser utilizada na subtração. Na caixa suspensa da imagem dois, selecione subtrair na caixa suspensa de operação e clique em ok.O ImageJ solicitará o processamento da pilha. Selecione sim. Uma nova pilha deverá aparecer, na qual foi removida a interferência entre os canais sobrepostos.Una as pilhas para recriar a mesma estrutura de imagem antes do alinhamento e subtração. Ao selecionar canais mesclados na janela de ferramentas de canais, a ferramenta permite a fusão de até quatro pilhas em uma hiperpilha. Por fim, aplique cores aos canais, ajuste o brilho e o contraste e salve os arquivos como tiffs para examinar a perda direcionada e a regeneração da nitroredutase.Células bipolares retinianas expressando mCherry. Uma série temporal de imagens confocais foi obtida em peixes-zebra individuais antes do tratamento. Há expressão em mosaico do marcador YFP ligado à membrana em células bipolares controladas, mostradas em amarelo, e da proteína de fusão nitroredutase-mCherry em bipolares direcionadas, mostradas em vermelho.O transgene marcado com CFP na membrana mostrado em ciano fornece informações contextuais sobre a maioria das outras células retinianas, aumentando a clareza. A mesma imagem sem o sinal de CFP é mostrada após o tratamento com metronidazol. As células bipolares expressando a nitroredutase em vermelho são perdidas, enquanto as células bipolares controladas em amarelo são poupadas.Isso demonstra a natureza altamente específica desta metodologia de ablacão. Novamente, a mesma imagem sem CFP é mostrada para maior clareza. Quando o metro NIAZ é removido, as células que expressam NTR retornam a este local.Um exemplo do método de subtração G-F-P-Y-F-P é mostrado nesta figura, com Mueller rotulado com GFP. As células GL são mostradas em verde e as células bipolares rotuladas com YFP são mostradas em roxo. A sobreposição entre as duas produz branco para realizar a subtração.As imagens GFP e YFP devem primeiro ser alinhadas. O processo de subtração permite então que as células bipolares marcadas com YFP sejam removidas da imagem GFP, possibilitando que as células Müller ggl marcadas com GFP sejam claramente representadas e células Müller mais fracas sejam detectadas. A sobreposição entre as células Müller fracas, ggl e as células bipolares marcadas com M cherry, mostradas em vermelho, pode agora ser verificada.Os dados apresentados aqui sugerem que a ablação das células bipolares desencadeia os ggl de Muller para substituir as células perdidas. Essa interpretação está de acordo com estudos recentes sobre regeneração retiniana, que implicam os ggl de Mueller como progenitores induzidos por lesão tanto em mamíferos quanto em peixes. Esta técnica permite aos pesquisadores explorar os mecanismos que regulam a regeneração de tipos celulares específicos por meio da visualização de células-tronco em peixes-zebra.

multicolor-time-lapse-imaging-transgenic-zebrafish-visualizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57485/ ablação-neuronal-população-usando-dois-fótons-laser-sua-avaliação'&gt;Muto, A., et al. Ablação de uma população neuronal usando um laser de dois fótons e sua avaliação usando imagens de cálcio e registro comportamental em larvas de peixe-zebra. J. Vis. exp. (2018) Neste vídeo, é demonstrado um procedimento de ablação a laser de dois fótons, permitindo a destruição seletiva de neurônios fluorescentes em larvas de...

Ablação neuronal direcionada usando microscopia de dois fótons em uma larava de peixe-zebra

Fonte: Lahne, M., et.al. Cultura de explantes retinianos de peixe-zebra transgênicos adultos para imagens de células vivas por microscopia multifotônica. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra imagens de células vivas da migração nuclear glial de Muller em explantes retinianos de peixe-zebra embebidos em agarose após danos por fotorreceptores induzidos por luz. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) liberado por fotorreceptores danificados ativa as células gliais de Muller, desencadeando a...

Imagem de células vivas da migração nuclear glial de Muller durante a regeneração da retina do peixe-zebra

Fonte: Williams, A. L., et al. Imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de células migratórias da crista neural em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra um protocolo de imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra em tempo real com alta resolução.

Visualizando a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra usando imagens de lapso de tempo multifóton

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Aqui apresentamos um método para a imagem do cérebro embrionário de zebrafish in vivo upto larval e juvenil estágios. Este procedimento microinvasivo, adaptado a partir de abordagens eletrofisiológicas, fornece acesso a detalhes celulares e subcelulares de neurônio maduro e pode ser combinado com estudos optogenéticos e neurofarmaológicos para caracterização da função cerebral e intervenção medicamentosa.

In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele

Aprenda a realizar imagem multicolor em tempo real e ablação celular direcionada em peixe-zebra transgênico. Este método permite visualizar a ativação de células-tronco da retina e estudar mecanismos de regeneração neural in vivo.

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal (Vídeo) | JoVE Journal

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

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