Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

A expressão de repórteres fluorescentes em animais transgênicos torna possível acompanhar as respostas celulares a manipulações experimentais em modelos vivos de doenças. Aqui, a perda seletiva de células é induzida farmacologicamente em peixe-zebra, utilizando confocal multicolorido de alta resolução. Imagens das células-alvo e de seus vizinhos imediatos são adquiridas imediatamente antes e após, bem como em intervalos espaçados após o tratamento com fármaco. A análise de imagem demonstra a ativação de populações endógenas de células-tronco e a subsequente substituição das células-alvo durante a fase de recuperação.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da biologia regenerativa, como quais são os mecanismos celulares e moleculares utilizados para regenerar tipos celulares específicos. Comece transferindo ovos transgênicos coletados de cruzamentos para uma placa de Petri contendo solução 0,3 x danio 16 horas após a fertilização. ADICIONE PTU para inibir a atividade da tirosina ACE antes de qualquer evidência de pigmentação no tecido de interesse. Se o embrião não for albino, incube os embriões a 28,5 graus Celsius.

Uma vez que os repórteres sejam evidentes, coloque a placa de Petri sob um microscópio estéreo fluorescente com zoom e selecione a expressão do transgene desejada. Antes da aquisição de imagens, prepare uma solução de montagem de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% em meio para embriões e armazene-a a 40 graus Celsius.

Adicione trica e PTU, se necessário. Misture suavemente e retorne à temperatura de 40 graus Celsius. Anestesie os peixes colocando-os no meio embrionário contendo trica.

Por aproximadamente três minutos, os peixes ficarão sem resposta. Ao tocar com uma micropipeta, aspire peixes individuais para dentro da ponteira recortada da pipeta, em um volume de aproximadamente 30 microlitros de solução anestésica. Em seguida, inverta a pipeta e permita que os peixes sedimentem no fundo.

Toque a ponta na solução de montagem e permita que as gotas se transfiram por gravidade. Tenha cuidado para não diluir a agro, de modo que ela possa ser reutilizada. Descarte a solução anestésica remanescente da micropipeta.

Em seguida, utilizando a mesma ponteira, transfira o peixe para uma placa de Petri. Em cerca de 30 microlitros de solução de montagem, posicione suavemente o peixe de modo que a região de interesse fique centralizada na gota de aerossol. Certifique-se de que o peixe permaneça na orientação desejada até que o aerossol solidifique.

Vários peixes podem ser montados em uma única placa de Petri, se desejado. Após a solidificação do ágar, transporte os peixes para a platina do microscópio confocal e adicione cuidadosamente meio para embriões contendo trica com ou sem PTU à placa até que os peixes fiquem completamente submersos. Abra o software de aquisição de imagens e foque na região de interesse para obter uma imagem ideal dos detalhes celulares e/ou moleculares.

Utilize objetivos de longa distância de trabalho com altas aberturas numéricas no software. Escolha os filtros de fluorescência apropriados na lista rotativa. Clique em configurações espectrais e faça ajustes nas faixas de emissão.

Para obter uma separação nítida dos sinais do repórter e maximizar as relações sinal-ruído, selecione o objetivo apropriado no menu suspenso para garantir que todos os ajustes predefinidos de software sejam corretamente configurados. Para focalizar os lasers e definir os níveis de potência, selecione uma saída da tabela de consulta que revele a saturação de pixels para cada canal.

Em seguida, ajuste a sensibilidade do detector para obter a qualidade de imagem desejada, aumentando gradualmente a saída do laser até que a intensidade da imagem seja aceitável. Evite a saturação de pixels na região de interesse e mantenha os níveis de laser tão baixos quanto possível. Para reduzir problemas de fotobranqueamento e fototoxicidade.

Certifique-se de que cada linha de laser produza sinal detectável apenas no canal apropriado, ligando e desligando manualmente os lasers enquanto monitora todos os canais de imagem. Se não houver evidência de diafonia, todos os canais podem ser adquiridos simultaneamente. Em seguida, delimite a área de interesse utilizando as funções de zoom e rotação.

Em seguida, defina a velocidade de varredura e o tamanho da imagem usando velocidades de varredura mais rápidas, o que minimiza o tempo de permanência do laser e aumenta a resolução temporal. Defina o tamanho do passo na dimensão Z de acordo com as necessidades experimentais. Aqui, um tamanho de passo de 10 micrômetros é utilizado para imagens de sete seções ópticas de tecido retiniano.

Uma vez que as configurações apropriadas tenham sido determinadas, adquira as imagens de Zack e salve-as. Em seguida, passe para o próximo peixe. A imagem com captura e liberação seriada pode ser realizada para acompanhar alterações celulares ao longo de dias sucessivos, conforme as instruções no documento escrito anexo.

Ao realizar um experimento de imagem com múltiplos marcadores, é melhor usar fluoróforos cujos espectros estejam bem separados. No entanto, isso nem sempre é prático. Aqui mostramos um método simples de subtração de imagens usando o software livre ImageJ para separar fluoróforos com perfis de excitação e emissão sobrepostos. No nosso caso, GFP e YFP.

As técnicas de imagem em linhas do tempo descritas neste vídeo foram utilizadas para monitorar células-tronco da retina marcadas com GFP durante a ablação e regeneração de neurônios bipolares da retina. Para realizar a separação espectral, colete imagens utilizando modos de imagem sequenciais e configurações variáveis de filtros de barreira, o que permite que fluorescências sobrepostas sejam adquiridas de forma independente e separadas parcialmente, respectivamente. Após a aquisição das imagens, utilize o complemento ImageJ Loc-i-Bio-Formas para abrir os arquivos de imagem e iniciar a ferramenta de importação. Arraste o arquivo de interesse para a janela do ImageJ.

Divida os canais em pilhas individuais usando a caixa de seleção dividir canais na janela de importação para iniciar o plugin alinhar três TP. Clique em plugins, depois em alinhar pilhas. Em seguida, alinhe três tp.

As pilhas devem ser alinhadas para garantir uma subtração adequada. Selecione a pilha de referência na primeira caixa suspensa e a pilha desalinhada na segunda. Marque as opções usar origem relativa XY e usar origem relativa Z e clique em ok.

Para iniciar o processo de alinhamento, clique no botão de registro de volume. Uma nova janela aparecerá contendo os parâmetros de alinhamento. Clique em OK.

Esta seção foi otimizada pelo distribuidor do plugin, portanto nenhuma modificação é necessária. Ao finalizar, uma janela de pilhas alinhadas aparecerá. Selecione a saída na janela alinhada para abrir a janela de saída.

Esta janela também é otimizada e não necessita de modificações. Clique em OK. Uma nova pilha aparecerá na área de trabalho com "alinhado" acrescentado ao final do título do arquivo.

Para remover a interferência cruzada usando a calculadora de imagens, clique em processar e depois em calculadora de imagens. Selecione a pilha que será subtraída na caixa suspensa da imagem um e a pilha a ser usada na subtração. Na caixa suspensa da imagem dois, selecione subtrair na caixa suspensa de operação e clique em ok.

O Image J solicitará o processamento da pilha. Selecione sim. Uma nova pilha deverá aparecer, na qual foi removida a interferência entre os canais sobrepostos.

Una as pilhas para recriar a mesma estrutura de imagem antes do alinhamento e subtração. Ao selecionar canais mesclados na janela de ferramentas de canal, a ferramenta permite a fusão de até quatro pilhas em uma hiperpilha. Por fim, aplique cores aos canais, ajuste o brilho e o contraste e salve os arquivos como tiffs para examinar a perda e regeneração direcionadas da nitrorredutase.

Células bipolares retinianas expressando M cherry. Uma série temporal de imagens confocais foi obtida em peixes-zebra individuais antes do tratamento. Há expressão em mosaico do marcador YFP marcado na membrana em células bipolares controladas, mostrado em amarelo, e proteína de fusão cherry redutora de nitro em bipolares direcionadas, mostrada em vermelho.

O transgene marcado com CFP na membrana, mostrado em ciano, fornece informações contextuais sobre a maioria das outras células retinianas, aumentando a clareza. A mesma imagem sem o sinal de CFP é mostrada após o tratamento com metronidazol. As células bipolares expressando a nitroredutase em vermelho são perdidas, enquanto as células bipolares controladas em amarelo são preservadas.

Isso demonstra a natureza altamente específica desta metodologia de ablacão. Novamente, a mesma imagem sem CFP é mostrada para maior clareza. Quando o metro NIAZ é removido, as células que expressam NTR retornam a este local.

Um exemplo do método de subtração G-F-P-Y-F-P é mostrado nesta figura, com Mueller rotulado com GFP. As células GL são mostradas em verde e as células bipolares rotuladas com YFP são mostradas em roxo. A sobreposição entre as duas produz branco para realizar a subtração.

As imagens GFP e YFP devem primeiro ser alinhadas. O processo de subtração permite então que as células bipolares marcadas com YFP sejam removidas da imagem GFP, possibilitando que as células Müller ggl marcadas com GFP sejam claramente representadas e células Müller mais fracas sejam detectadas. A sobreposição entre as células Müller fracas, ggl e as células bipolares marcadas com M cherry, mostradas em vermelho, pode agora ser verificada.

Os dados apresentados aqui sugerem que a ablação das células bipolares desencadeia os ggl de Müller para substituir as células perdidas. Essa interpretação está de acordo com estudos recentes sobre regeneração retiniana, que implicam os ggl de Müller como progenitores induzidos por lesão em mamíferos e peixes. Esta técnica permite aos pesquisadores explorar os mecanismos que regulam a regeneração de tipos celulares específicos por meio da visualização de células-tronco em peixe-zebra.