Silenciamento de genes baseado em transfecção reversa de siRNA in vitro: um procedimento para entregar pequenos RNAs interferentes em células cultivadas para inativar a expressão do gene alvo

Para a transfecção reversa de pequenos RNAs interferentes, ou siRNA, uma classe de RNA de fita dupla, em adipócitos ou células de gordura não aderentes, prepare uma suspensão de siRNAs direcionada a um gene codificador de proteína específico em adipócitos. Adicione um reagente de transfecção à base de lipídios catiônicos adequado. Incube a mistura para formar complexos de transfecção por meio de interações eletrostáticas.

Transfira a mistura para poços revestidos de colágeno de uma placa de vários poços. Os complexos de transfecção imobilizam no revestimento da placa por interações não específicas. Pipetar uma suspensão de adipócitos em poços contendo complexos de transfecção imobilizados. Os adipócitos aderem frouxamente ao revestimento da placa, aumentando o contato físico entre as células e os complexos.

O complexo de transfecção se funde à membrana celular e entrega o siRNA ao citoplasma. O siRNA, compreendendo uma fita antisense com uma sequência complementar ao mRNA alvo e uma fita sensorial, é reconhecido pelo complexo silenciador indutor de RNA multiproteico, ou RISC. O siRNA se liga ao RISC e as fitas se separam, com a fita antisense permanecendo ligada ao complexo.

O complexo siRNA-RISC ativado reconhece e se liga aos locais complementares no mRNA alvo. Isso leva à clivagem específica da sequência do mRNA pela proteína argonauta do complexo RISC. O mRNA clivado é ainda mais degradado pela maquinaria celular, silenciando assim a expressão do gene alvo.