Transgênese de peixe-zebra mediada por transposon Tol2: um procedimento para gerar peixe-zebra transgênico após a coinjeção do sistema Tol2 em embriões de peixe-zebra fertilizados

Comece com embriões de peixe-zebra viáveis em estágio de uma célula colocados nos poços de um molde de microinjeção.

Carregar uma agulha de microinjecção com uma solução contendo ARNm codificador de transposase Tol2 e plasmídeos dadores de transposões. Os plasmídeos compreendem um promotor onipresente de peixe-zebra e um gene codificador de proteína fluorescente flanqueado por braços de transposon Tol2.

Injete cuidadosamente a solução de microinjeção no citoplasma do embrião de peixe-zebra. Dentro da célula, os mRNAs da transposase Tol2 se traduzem em proteínas transposase Tol2 e são ativamente transportados para o núcleo.

Os locais Tol2 no plasmídeo doador compreendem repetições terminais invertidas específicas, ou ITRs, flanqueando o gene repórter. Os ITRs são flanqueados por repetições curtas e diretas. As proteínas transposase reconhecem e se ligam aos sítios ITR, formando um grampo no DNA flanqueador. As transposases clivam ainda mais a construção do transposon do DNA flanqueador, liberando-o do plasmídeo e deixando para trás repetições curtas e diretas.

As transposases criam uma quebra de fita dupla escalonada no genoma da célula somática e inserem a construção do transposon no sítio do genoma. O preenchimento da lacuna das extremidades escalonadas pela DNA polimerase seguido pela ligação dos cortes cria repetições curtas e diretas.

A ligação causa integração estável da construção do transposon no genoma da célula somática e o promotor facilita a expressão da proteína fluorescente. Incube os embriões injetados. Durante o desenvolvimento embrionário, as células somáticas dão origem a diferentes tipos de células e criam peixes-zebra transgênicos.