Silenciamento de genes baseado em transfecção reversa de siRNA in vitro: um procedimento para entregar pequenos RNAs interferentes em células cultivadas para inativar a expressão do gene alvo

Pipete o siRNA com meio essencial mínimo aprimorado para misturar e incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione o reagente de transfecção e o meio essencial mínimo aprimorado ao siRNA e pipete para misturar. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.

Lave as células na placa de Petri de 100 milímetros duas vezes com DPBS. Adicione 5X tripsina às células, certificando-se de cobrir toda a superfície com a tripsina. Aguarde 30 segundos e remova cuidadosamente a tripsina. Incubar a placa de Petri durante 5 a 10 minutos a 37 °C na incubadora.

Em seguida, bata no prato para separar as células, evitando danos às células. Adicione 10 mililitros de DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% de FCS e 1% de penicilina e estreptomicina, para neutralizar a tripsina. Pipetar cuidadosamente o meio para cima e para baixo para separar as células e homogeneizar a suspensão celular.

Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador de células automatizado e ajuste a concentração das células para 6,25 x 10⁵ células / mL de meio. Semeie 800 microlitros da suspensão celular por poço de uma placa de 12 poços, ou 400 microlitros da suspensão celular por poço de uma placa de 24 poços contendo a mistura de transfecção.

Incube as placas em uma incubadora de cultura de células e não as perturbe por 24 horas. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o sobrenadante por DMEM fresco sem piruvato, glicose 25 mM, FCS 10% e penicilina e estreptomicina 1% e retorne as células à incubadora.