Western Blotting de célula única para determinar a heterogeneidade celular

Os locais de inflamação contêm várias células imunológicas, incluindo monócitos, macrófagos e leucócitos.

Para identificar uma população de células heterogêneas por western blotting unicelular, pegue um chip de blotting pré-hidratado, consistindo em um gel de poliacrilamida fotoativável padronizado em blocos. Cada bloco possui vários micropoços. A padronização em vários blocos captura várias células em paralelo.

Adicionar uma suspensão contendo uma população celular heterogénea. As dimensões do poço permitem que células individuais se assentem. Mergulhe o chip em uma câmara de eletroforese cheia de um tampão apropriado. As moléculas de detergente no tampão rompem a membrana da célula, liberando conteúdo celular.

Aplique um campo elétrico. As proteínas liberadas migram através do gel, separando-se em bandas de tamanhos distintos. Lave o chip com um tampão de lavagem para remover moléculas não especificamente ligadas, deixando apenas proteínas celulares, incluindo as proteínas marcadoras desejadas.

Exponha o gel à luz UV, ativando sua superfície e imobilizando as proteínas.

Adicione um coquetel de anticorpos primários que se ligam especificamente a proteínas marcadoras distintas de cada tipo de célula, formando complexos de anticorpos primários proteínas. Dispense uma mistura de anticorpos secundários marcados com fluorescência, que se ligam aos seus respectivos anticorpos primários, marcando a proteína marcadora específica da célula correspondente.

Coloque o chip em um scanner. Medir a intensidade de fluorescência que é proporcional ao nível de expressão do marcador proteico correspondente específico para uma única célula da suspensão de células da amostra.