Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

O objetivo geral deste procedimento é comparar as concentrações de muitas proteínas entre amostras por espectrometria de massa utilizando proteômica pronta. Isso é realizado primeiramente digerindo a proteína de cada amostra para gerar misturas de peptídeos. Em seguida, as duas amostras são misturadas, e os peptídeos na amostra combinada são fracionados e dessalinizados.

Em seguida, a amostra mista é analisada por espectrometria de massa. Por fim, os peptídeos são identificados comparando-se os dois espectros de MS com uma base de dados alvo e decoy de todos os peptídeos potenciais nas amostras, e a abundância relativa dos peptídeos entre as amostras é quantificada. Em última análise, a proteômica pronta permite a quantificação da abundância relativa de muitas proteínas entre amostras complexas.

As principais vantagens da desmetilação redutiva em comparação com outros métodos de marcação com isótopos estáveis, como o iLite, são que o método é rápido, econômico e preciso, não exigindo um meio sintético específico ou condições especiais, o que significa que pode ser aplicado a quase qualquer tipo de amostra. Para começar, prepare um miligrama de proteína celular e 500 microlitros utilizando sonicador ou prensa de French para lisar as células e precipitar as proteínas. Adicione um volume de ácido tricloroacético a quatro volumes de proteína e resfrie no gelo por 10 minutos.

Centrifugue a 12.000 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante. Em seguida, use um mililitro de acetona gelada para ressuspender. Suspenda o pellet antes de centrifugar uma segunda vez.

Após aspirar o sobrenadante, seque o pellet em um bloco térmico de 56 graus Celsius para desnaturar as proteínas e reduzir as ligações de sulfeto do corante. Utilize 500 microlitros de tampão desnaturante e redutor para reconstituir. Reconstitua as proteínas até aproximadamente dois miligramas por mililitro.

Incube as proteínas por 30 minutos a 56 graus Celsius, seguido por 10 minutos à temperatura ambiente. Para alquilar grupos sulfeto livres, adicione 25 microlitros de 0,3 molar de acetamida IDO recém-preparada em água a 500 microlitros de proteína e incube no escuro por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, interrompa a reação adicionando 10 microlitros de DTT três milimolar.

Armazene as proteínas alquiladas a menos 80 graus Celsius. Para digerir as proteínas alquiladas após a precipitação com ácido tricloroacético, utilize ureia um molar em 50 milimolar de hepes pH 8,2 para ressuspender a proteína. Prepare uma solução estoque de Lys-C, endoproteinase ou ly C em água numa concentração de dois microgramas por microlitro e adicione a enzima à proteína digerida numa concentração final de 10 nanogramas por microlitro. As amostras são deixadas à temperatura ambiente por seis horas ou durante a noite. Suspenda 20 microgramas de tripsina de grau sequenciamento em 40 microlitros de ácido acético 50 milimolar e adicione cinco microlitros à reação de digestão com ly C.

Incube por seis horas a 37 graus Celsius com as proteínas alquiladas. Adicione ácido trifluoroacético ou TFA até uma concentração final de 0,5%. Conecte uma coluna C18 a um manifold de extração. Em seguida, use seis mililitros de acetonitrila ou ACN para umedecer a coluna.

Em seguida, com a vazão mais alta possível, utilize seis mililitros de ACN 80% com TFA 0,1% para lavar a coluna antes de usar seis mililitros de TFA 0,1% para equilibrar a coluna, pare a pressão a vácuo e carregue 500 microgramas de peptídeos na coluna a uma vazão de aproximadamente um mililitro por minuto. Uma vez que os peptídeos estejam ligados à coluna, reinicie o vácuo e, com a vazão mais alta possível, use TFA 0,1% seguido por três mililitros de tampão de ácido cítrico para lavar a coluna, a fim de realizar marcação com dimetilação redutiva ou com ready label. Sob uma câmara de exaustão química, prepare 12 mililitros de cada tampão ready leve e pesado para metilar peptídeos livres.

Adicione 10 mililitros do tampão pronto leve ou pesado à coluna a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Após aplicar uma segunda alíquota de 10 mililitros, para garantir a marcação, utilize seis mililitros de TFA 0,1%, seguidos por um mililitro de ácido acético 0,5%.

Para lavar a coluna e eluir as proteínas, pare o vácuo e aplique um mililitro de 40% a CN 0,5% de ácido acético a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto. Em seguida, adicione um mililitro de 80% a CN 0,5% de ácido acético e elua com uma seringa de cinco mililitros, se desejado. Misture uma proporção de um para um de amostras de peptídeos marcados com isótopos pesados e leves e quantifique por espectrometria de massas para garantir que a marcação pesada e leve foi eficaz. Fracione a mistura de peptídeos aplicando-a primeiramente a uma coluna C 18 HPLC.

Em seguida, após lavar a coluna com 5% A CN por cinco minutos, utilize um gradiente de cinco a 35% A CN ao longo de 60 minutos para eluir os peptídeos em frações iguais. Em uma placa de 96 poços, seguido por 90% A CN por um minuto. Após mais quatro minutos com 90% A CN, utilize 5% A CN para reequilibrar a coluna.

Em seguida, combine as frações da seguinte maneira com a centrífuga a vácuo. Remova o solvente das frações combinadas. Em seguida, utilize 130 microlitros de ureia 1 molar com 0,5% de TFA para ressuspender.

Suspenda os peptídeos das frações a seguir e armazene o conjunto de frações a menos 20 graus Celsius para realizar a extração stop and go nas frações ressuspendidas. Prepare microcolunas de ponta C18 a partir de ponteiras de pipeta de 200 microlitros utilizando dois discos C18 com diâmetro interno de 1,07 milímetro para preenchê-las. Coloque as pontas em tubos de microcentrífuga e adicione 130 microlitros de metanol e centrifugue.

Em seguida, adicione 130 microlitros de ACN 80% com 0,5% de ácido acético antes de centrifugar novamente, após usar 130 microlitros de TFA 0,1% para equilibrar as pontas, transfira a mistura de peptídeos para as pontas e lave. Primeiro com 130 microlitros de TFA 0,1%, seguido por 40 microlitros de TFA 0,1%. Em seguida, 40 microlitros de ácido acético 0,5% para eluir os peptídeos.

Primeiro, adicione 20 microlitros de 40% a um ácido acético CN 0,5%. Em seguida, 20 microlitros de 80% a um ácido acético CN 0,5%. Combine os IITs e o filtrado a vácuo até secagem para realizar a cromatografia líquida em microcapilar.

A espectrometria de massas em tandem ou L-C-M-S-M-S começa utilizando ácido fórmico 5%, A CN 5% para ressuspender as proteínas até uma concentração de aproximadamente um micrograma por microlitro. Aplique aproximadamente um micrograma de peptídeos em uma coluna C 18 de fase reversa de 100 micrômetros por 20 centímetros e elua utilizando um gradiente de 6 a 22% de A CN em ácido fórmico 0,125% a uma taxa de fluxo de aproximadamente 300 nanolitros por minuto, aplicado ao longo de 75 a 100 minutos.

Utilize um espectrômetro de massas com alta resolução e alta precisão de massa e identifique os peptídeos na amostra comparando arquivos brutos de espectros MS/MS a uma base de dados teórica com um algoritmo como o SEQUEST, usando os parâmetros mostrados aqui com a base de dados de quadros de leitura abertos nas orientações direta e reversa. Filtre os peptídeos para uma taxa de descoberta falsa de 1% com um método como o alvo decoy. Para quantificar os peptídeos identificados, calcule as áreas dos pares pesados e leves de cromatogramas de íons extraídos MS1 e as razões sinal-ruído dos peptídeos. Inclua pares de peptídeos somente quando sua razão média sinal-ruído for superior a cinco. Quantifique a abundância relativa de um peptídeo nas duas amostras como a razão das áreas dos picos MS1 das versões pesada e leve do mesmo peptídeo. Calcule as abundâncias relativas das proteínas como a razão mediana das áreas dos picos MS1 para todos os peptídeos na proteína, quando filtrados para uma taxa de descoberta falsa de peptídeos de 1%.

A eficiência de marcação pronta de uma mistura de c phyto ferment proveniente de culturas marcadas com isótopos pesados e leves, contendo 11.194 sequências peptídicas únicas, foi de 98%. O lisado proteico total de visier não fracionado foi analisado de maneira semelhante. As diferenças na expressão proteica refletem de forma reprodutível as proporções nas quais as amostras pesadas e leves foram misturadas, em uma ampla faixa de razões de mistura. Especificamente, a variação de 99% das proteínas foi inferior a 1,6 nas amostras misturadas na proporção de um para um, bem como nas amostras com proporções de um para dez e dez para um.

99% das proteínas estavam dentro de 3,8 vezes a razão esperada, mostrando um aumento no desvio padrão à medida que a distância aumentava em relação à mistura um para um. Quando a marcação pronta foi aplicada ao proteoma do Clostridium phytofermentans, mais de 2000 proteínas foram quantificadas, com 94% das proteínas medidas dentro de níveis de duas vezes para culturas replicadas crescendo em dobra proteica de glicose. As alterações para pares duplicados de culturas também foram altamente correlacionadas.

Em conjunto, esses experimentos indicam que a proteômica Ready é um método preciso e reprodutível para quantificar diferenças na expressão proteica entre amostras complexas. Como essa técnica pode ser aplicada praticamente a qualquer tipo de amostra, abriu caminho para pesquisadores na área de proteômica explorarem alterações na expressão proteica em todos os tipos de amostras, incluindo microrganismos novos, células de peixes e de mamíferos.