Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

O objetivo geral deste procedimento é comparar as concentrações de muitas proteínas entre amostras por espectrometria de massa usando proteômica pronta. Isso é feito digerindo primeiro a proteína de cada amostra para gerar misturas de peptídeos. Em seguida, as duas amostras são misturadas e os peptídeos na amostra mista são fracionados e dessalinizados.

Em seguida, a amostra mista é então analisada por espectrometria de massa. Finalmente, os peptídeos são identificados comparando os espectros MS dois com um banco de dados de chamariz alvo de todos os peptídeos potenciais nas amostras e a abundância relativa de peptídeos entre as amostras é quantificada. Em última análise, a proteômica pronta permite a quantificação da abundância relativa de muitas proteínas entre amostras complexas.

As principais vantagens da desmetilação redutiva sobre outros métodos de marcação de isótopos estáveis, como o iLite, é que o pronto é um método rápido, barato e preciso que não requer trois específico ou um meio sintético, o que significa que pode ser aplicado a praticamente qualquer tipo de amostra. Para começar, prepare um miligrama de proteína celular e 500 microlitros usando sonicação ou uma prensa francesa para colocar as células para precipitar as proteínas. Adicione um volume de ácido triclorótico a quatro volumes de proteína e leve à geladeira por 10 minutos.

Centrifugar a 12 000 Gs durante cinco minutos a quatro graus Celsius e retirar o sobrenadante. Em seguida, use um mililitro de acetona gelada para Resus. Suspenda o pellet antes de girar uma segunda vez.

Depois de aspirar o snat, seque o pellet em um bloco de calor de 56 graus Celsius para desnaturar as proteínas e reduzir as ligações de sulfeto do corante. Use 500 microlitros de tampão de desnaturação e redução para reus. Ressuspenda as proteínas para aproximadamente dois miligramas por mililitro.

Incube as proteínas por 30 minutos a 56 graus Celsius, seguido de 10 minutos em temperatura ambiente. Ao lado dos grupos de sulfeto livre de alquilados, adicione 25 microlitros de acetamida IDO 0,3 molar recém-preparada em água a 500 microlitros de proteína e incube no escuro por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, extinguir a reação adicionando 10 microlitros de três TDT milimolares.

Armazene as proteínas alquiladas a 80 graus Celsius negativos para digerir as proteínas alquiladas após a precipitação do TCA, use uma uréia molar em 50 milimolares heis pH 8,2 para ressuspender a proteína. Prepare uma solução de estoque de Lysol, endo proteinase ou ly C em água a uma concentração de dois microgramas por microlitro e adicione a enzima à proteína digerida a uma concentração final de 10 nanogramas por microlitro as amostras são deixadas em temperatura ambiente por seis horas ou durante a noite. Suspenda 20 microgramas de tripsina de grau sequencial em 40 microlitros de ácido acético 50 milimolar e adicione cinco microlitros à reação de digestão da lice.

Incubar por seis horas a 37 graus Celsius até as proteínas alquiladas. Adicione ácido acético trifluor ou TFA a uma concentração final de 0,5% Conecte uma coluna C 18 a um coletor de extração. Em seguida, use seis mililitros de aceto nitrilo ou um CN para molhar a coluna.

Em seguida, com a maior vazão possível, use seis mililitros de 80% a CN 0,1% TFA para lavar a coluna antes de usar seis mililitros de 0,1% TFA para equilibrar a coluna, pare a pressão de vácuo e carregue 500 microgramas de peptídeos na coluna a uma taxa de fluxo de aproximadamente um mililitro por minuto. Uma vez que os peptídeos estejam ligados à coluna, reinicie o vácuo e com a maior vazão possível, use 0,1% de TFA seguido de três mililitros de tampão de ácido cítrico para lavar a coluna para realizar onco, redutor, metilação fraca ou rotulagem pronta. Sob uma capa química, prepare 12 mililitros de cada um dos tampões leves e pesados prontos Tom Methylate sem peptídeos.

Um meio adiciona 10 mililitros de tampão pronto leve ou pesado à coluna a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Depois de aplicar uma segunda alíquota de 10 mililitros. Para garantir a rotulagem, use seis mililitros de 0,1% de TFA, seguidos de um mililitro de ácido acético a 0,5%.

Para lavar a coluna para eluir as proteínas, pare o vácuo e aplique um mililitro de 40% a um ácido acético NC 0,5% a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto. Em seguida, adicione um mililitro de 80% a CN 0,5% de ácido acético com uma seringa de cinco mililitros, se desejar. Misture uma proporção de um para um de amostras de peptídeos marcados com pesados e leves e quantifique por espectrometria de massa para garantir que a marcação leve e leve tenha sido eficaz para fracionar a mistura de peptídeos aplicando-a primeiro a uma coluna de HPLC C 18.

Então, depois de usar 5%a CN para lavar a coluna por cinco minutos, use um gradiente de cinco a 35%a CN por 60 minutos para eluir os peptídeos em frações iguais. Em uma placa de 96 poços, seguida de 90%A CN por um minuto. Após mais quatro minutos de 90% A CN, use 5% a CN para reequilibrar a coluna.

Em seguida, combine as frações da seguinte maneira com a centrífuga a vácuo. Remover o solvente das fracções combinadas. Em seguida, use 130 microlitros de ureia molar 0,5% TFA para Resus.

Suspenda os peptídeos das frações seguintes e armazene o conjunto de frações a 20 graus Celsius negativos para realizar, parar e ir extração nas frações ressuspensas. Prepare microcolunas de ponta C 18 stage a partir de pontas de pipeta de 200 microlitros usando dois discos C 18 com diâmetro interno de 1,07 milímetro para embalá-las. Coloque as pontas do palco em tubos de microcentrífuga e adicione 130 microlitros de metanol e centrifugação.

Em seguida, adicione 130 microlitros de ácido 80% a CN 0,5% acético antes de girar novamente após usar 130 microlitros de 0,1% TFA para equilibrar as pontas, transfira a mistura de peptídeos para as pontas e lave. Primeiro com 130 microlitros de 0,1% de TFA, seguido por 40 microlitros de 0,1% de TFA. Em seguida, 40 microlitros de ácido acético a 0,5% para eluir os peptídeos.

Primeiro, adicione 20 microlitros de 40% a um ácido acético CN 0,5%. Em seguida, 20 microlitros de 80% a CN 0,5% de ácido acético. Combine os IITs e o filtrado a vácuo para secar para realizar a cromatografia líquida microcapilar.

A espectrometria de massa em tandem ou LCMS começa usando ácido fórmico a 5% e CN a 5% A para ressuspender as proteínas a uma concentração de aproximadamente um micrograma por microlitro. Aplique aproximadamente um micrograma de peptídeos em um micrômetro de 100 por 20 centímetros C 18. Coluna e eluição de HPLC de fase reversa usando um gradiente de seis a 22% de um CN em 0,1 25% de ácido fórmico a uma taxa de fluxo de aproximadamente 300 nanolitros por minuto, aplicada por 75 a 100 minutos.

Use um espectrômetro de massa com alta resolução e alta precisão de massa e identifique peptídeos na amostra comparando Ms.Ms arquivos brutos do Spectra com um banco de dados teórico com um algoritmo como o SE quest, usando os parâmetros mostrados aqui com o banco de dados de quadros de leitura abertos nas orientações real e reversa filtram peptídeos para uma taxa de descoberta falsa de 1% com um método como o chamariz alvo. Para quantificar os peptídeos identificados, calcule as áreas de pares pesados e leves de cromatogramas de íons extraídos MS um e as relações sinal-ruído peptídicas incluem pares de peptídeos somente quando sua relação sinal-ruído média estiver acima de cinco. Quantifique a abundância relativa de um peptídeo nas duas amostras como a proporção de áreas de pico de MS um das versões pesada e leve do mesmo peptídeo, calcule as abundâncias proteicas relativas como a proporção mediana de área de pico de MS para todos os peptídeos na proteína quando filtrada para uma taxa de descoberta falsa de 1% de peptídeo.

A eficiência de marcação pronta de uma mistura de fito fermento c de culturas marcadas pesadas e leves que contêm 11.194 sequências peptídicas únicas foi de 98% O lisado de proteína visier não fracionado foi analisado de forma semelhante. As diferenças de expressão de proteínas refletem de forma reprodutível as proporções nas quais as amostras pesadas e leves foram misturadas em uma ampla gama de proporções de mistura. Especificamente, a mudança de fo de 99% das proteínas foi menor que 1,6 para as amostras mistas de um para um nas amostras de um para 10 e 10 para um.

99% das proteínas estavam dentro de 3,8 vezes a proporção esperada, mostrando um aumento no desvio padrão a uma distância maior de uma mistura um-para-um. Quando a marcação pronta foi aplicada ao proteoma do fito fermento de Clostridium, mais de 2000 proteínas foram quantificadas com 94% de proteínas medidas em níveis duplos para culturas replicadas crescendo em dobra de proteína de glicose. As alterações para pares duplicados de culturas também foram altamente correlacionadas.

Juntos, esses experimentos sustentam que a proteômica Ready é um método preciso e reprodutível para quantificar as diferenças de expressão de proteínas entre amostras complexas. Como essa técnica pode ser aplicada a praticamente qualquer tipo de amostra, ela abriu caminho para pesquisadores no campo da proteômica explorarem as mudanças na expressão de protes em todos os tipos de amostras, incluindo novos micróbios, peixes e células de mamíferos.