Name: Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda proteômica quantitativa por espectrometria de massa usando marcação por dimetilação redutiva (ReDi). Este método rápido e econômico permite quantificar proteínas em amostras complexas com alta precisão.

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Agradecemos a SP Gygi e GM Church pela ajuda e orientação. Este trabalho foi apoiado por uma cadeira de excelência do CNRS para a ACT.

NOTA: Este método foi descrito anteriormente 12. 1. Isolamento de Proteínas Prepare 1 mg de proteína celular por lise das células, de preferência, por meio de métodos físicos, tais como a prensa francesa, grânulo batimento, ou de ultra-sons. Evitar a lise celular mediada por lisozima porque a enzima irá confundir medições de espectrometria de massa. 2. Precipitação de TCA de Proteínas Adicionar 1 volume de ácido tricloroacético (TCA) a proteína de 4 volumes e frio em gelo durante 10 min para precipitar as proteínas. Centrifugar a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 ml de acetona gelada e centrifugar a 12000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e inverter o tubo no banco para secar o sedimento durante 15 minutos. Peletes de proteína Armazenar a -80 ° C. 3. Desnaturar proteínas e Reduzir dissulfeto Bonds Resuspender as proteínas para ~ 2 mg / ml em 500 ul de tampão de desnaturação e de redução (ou ureia 4 M ou 3% de SDS em 50 mM de HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). Opcionalmente, incluem um inibidor da protease no buffer. Incubar as proteínas durante 30 minutos a 56 ° C, seguido de 10 min à temperatura ambiente. 4. Aklylate grupos livres Sulfidrila para interromper irreversivelmente Formação Dissulfeto de Bond Prepare fresco 0,3 M iodoacetamide na água. ATENÇÃO! Iodoacetamida é altamente tóxico. Adicionar 25 ul de 0,3 M iodoacetamida (15 mM de concentração final) a 500 ul de proteína e incubar durante 20 min no escuro à temperatura ambiente. Extingue-se por adição de iodoacetamida 10 ul de 300 mM DTT (5 mM de concentração final de DTT). Armazenar proteínas alquiladas a -80 ° C. 5. Digestão de proteínas TCA precipitar as proteínas (tal como descrito na etapa 2) e ressuspender em 1 ml de HEPES 50 mM (pH 8,2), 1 M de ureia. Prepare uma solução estoque de Lisil endoproteinase (Lys-C) em água a uma concentração de 2 mg / mL e adicionam-se 5 ul da solução de proteína. Incubar a mistura durante 16 horas à temperatura ambiente. Assegurar a concentração final Lys-C é de 10 ng / mL e a relação de proteína para LysC (w / w) é de 1/50 a 1/200. Ressuspender 20 ug de tripsina de grau de sequenciação em 40 ul de 50 mM de ácido acético, adicionam-se 5 uL (10 ug de tripsina) a Lis-C digest, e incubar durante 6 horas a 37 ° C. Usar a mesma concentração de protease e os rácios de protease-proteína para Lis-C, tal como utilizado para a tripsina. 6. De fase inversa Peptide Extracção <ol><li> Acidifica-se péptidos por adição de ácido trifluoroacético (TFA) até uma concentração final de 0,5% (pH ≈ 2). Anexar uma coluna C18 de um colector de extração. Utilize a maior taxa de fluxo possível para todos os passos excepto a carga e eluição dos peptídeos. </li><li> Wet coluna com 6 ml de acetonitrila (ACN). Lavar coluna com 6 ml de 80% de ACN, 0,1% de TFA, em seguida equilibrar-se com 6 ml de TFA a 0,1%. Não permita que ocoluna para secar entre as etapas. </li><li> Pare a pressão de vácuo e carregar 500 ug de péptidos para a coluna a uma taxa de fluxo de aproximadamente 1 ml / min. Uma vez que os péptidos se ligaram à coluna, a reinicialização vácuo e lavar com 6 mL de TFA a 0,1%, em seguida com 3 ml de tampão de ácido cítrico (ácido cítrico 0,09 M, 0,23 M de Na 2 HPO 4, pH 5,5). Nota: os valores mais elevados de péptidos podem ser marcados, mas a coluna C18 capacidade de ligação deve ser pelo menos duas vezes maior do que a quantidade de péptido para evitar a perda de amostra. </li></ol> 7. On-coluna Peptide Labeling por redutora dimetilação (Redi Labeling) Execute esta etapa sob um capuz químico como cianeto de hidrogênio é liberado em baixa concentração durante o processo de rotulagem. <ol><li> Prepare 12 ml de &quot;leves&quot; e &quot;pesados&quot; buffers REDI de metilato aminas peptídeo livres. Tampão Redi Luz consiste de 0,8% de formaldeído e 0,12 M cianoborohidreto de sódio levando hidrogênios em poeir distribuições isotópicas naturais em tampão de ácido cítrico. Tampão Redi pesada consiste em 0,8% de formaldeído deuterado e 0,12 M deuterado cianoborohidreto de sódio em tampão de ácido cítrico. </li><li> Incubar coluna contendo peptídeos por adição de 10 ml ou de luz ou de tampão Redi pesada para as colunas contendo péptidos em taxa de fluxo de 1 ml / min e repetir a assegurar a rotulagem completa. Lavar a coluna com 6 ml de TFA a 0,1% e, em seguida, com ácido acético a 1 ml de 0,5%. </li><li> Pare vácuo e eluir péptidos marcados em primeiro lugar com 1 mL de 40% de ACN, 0,5% de ácido acético, em seguida com 1 mL de 80% de ACN, 0,5% de ácido acético, utilizando uma taxa de fluxo de aproximadamente 0,5 ml / min. Se desejar, medir a eficiência de marcação de amostras individuais por espectrometria de massa antes de misturar amostras leves e pesados ​​(ver &quot;Os resultados representativos&quot;). Misturar 01:01 amostras de péptidos pesados ​​e etiquetados-luz para ser quantificada por espectrometria de massa. </li></ol> 8. Mistura Peptide separado por pH básico invertida Fase cromatografia (BPRP) &lt;/ P&gt; PH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia para separar a mistura de péptidos em várias fracções, que são analisadas de forma independente por LC-MS/MS para aumentar a cobertura do proteoma. <ol><li> Fraccionar a mistura de péptidos numa coluna C18 de HPLC através da aplicação de um gradiente de concentração crescente de ACN em 10 mM de bicarbonato de amónio (pH 8). Comece com 5% (v / v) de ACN durante 5 minutos, para aumentar a 35% de ACN em 60 min, e em seguida a 90% de ACN em 1 min. Reter a ACN 90% durante 4 minutos antes de reduzir o ACN a 5% para re-equilibrar a coluna durante 9 min. Recolha 96 fracções de igual volume de uma placa de 96 poços (de A1 a H12). Monitorar a fraccionamento utilizando um detector de UV a 220 nm, enquanto que os péptidos são eluição da coluna (10-70 min para as condições aqui descritas). </li><li> Combine frações de poços A1, C1, E1 e G1 (fração A1), a partir de poços B1, D1, F1 e H1 (fração B1), a partir de poços A2, C2, E2 e G2 (fração A2) e, consequentemente, para a demais frações. Remover o solvent usando uma centrífuga de vácuo. Ressuspender a partir de fracções de péptidos de A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11, B12 e em 130 ul de 1 M urea/0.5% TFA e purificar usando StageTips como descrito no passo 9. Loja frações B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, A12 e à temperatura de -20 º C. </li></ol> 9. Purify Peptídeos por parar e ir Extraction (StageTips) Prepare C18-7 StageTip microcolunas embalando 200 dicas mL pipeta com duas C18 discos com um diâmetro interno (ID) de 1,07 mm. Coloque Dicas Stage em tubos Eppendorf. Use uma microcentrífuga para lavar dicas com 130 mL de metanol, em seguida, 130 ul de 80% ACN, ácido acético 0,5%. Equilibrar StageTips com 130 mL TFA 0,1%. Transferir a mistura de péptidos de StageTips e lava-se com 130 ul de 0,1% de TFA, em seguida, 40 ul de 0,1% de TFA, em seguida, 40 ul de ácido acético a 0,5%. Eluir péptidos primeiro com 20 ul de 40% ACN, 0,5% de ácido acético, em seguida, 20 ul de 80% ACN, 0,5% de ácido acético. Combine um eluatosnd seco por filtração sob vácuo. 10. Microcapilares LC-MS/MS <ol><li> Dissolve-se os péptidos em 1-5 mL de ácido fórmico a 5%, 5% de ACN a uma concentração de aproximadamente 1 mg / mL. Resolver ~ 1 ug péptidos sobre uma 100 um × 20 cm, C18-invertidos coluna de HPLC de fase com um gradiente de 6-22% de ACN em ácido fórmico a 0,125% aplicados sobre 75 ou 100 min a uma taxa de fluxo de ~ 300 nl / min. </li><li> Identificar peptídeos usando um LTQ Orbitrap Velos 12 ou plataforma semelhante cromatografia líquida-espectrometria de massa com um espectrômetro de massa fornecendo alta resolução e precisão de massa de alta. Operar o espectrômetro de massa no modo dependente de dados com uma completa varredura MS (resolução de 60.000) adquirido no analisador Orbitrap. Gerar ion trap linear espectros MS / MS para as 20 mais abundantes iões detectados no espectro de MS completa. Definir controle de ganho automático (AGC) metas para 1 x 10 6 para o pleno MS e 2.000 para MS / MS. Definir máximas vezes acúmulo de íons de 1.000 mspara MS e 150 ms para MS / MS. Excluir íons peptídeo precursor fragmentadas de uma maior seleção de MS / MS para 20-60 seg. </li></ol> 11. MS / MS de Aquisição de Dados Identificar peptídeos comparando espectros MS / MS arquivos RAW para um banco de dados teóricos com um algoritmo como SEQUEST 8 usando esses parâmetros (Tabela 1). Tabela 1. Peptídeo de banco de dados da pesquisa Parâmetros. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Parâmetros Gerais </td><td> digestão totalmente tryptic com até 2 perdeu clivagens </td></tr><tr height="19"><td> Tolerância íon precursor ppm 25 </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 tolerância íon fragmento Da </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Modificações estáticos </strong&gt; </td><td> Da 57,02146 em cisteína, carboxyamidomethylation </td></tr><tr height="19"><td> Da 28,03130 em lisina e o péptido N-terminal, a etiqueta dimetilação luz </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Modificações dinâmicas </td><td> Da 15,99491 em metionina, a oxidação </td></tr><tr height="19"><td> 6,03766 Da em lisina e o péptido N-terminal, a etiqueta dimetilação pesado </td></tr></tbody></table><ol><li> Filtrar péptidos a uma taxa de detecção falso 1% com um método tal como a estratégia de 9-alvo chamariz utilizando uma base de dados de estruturas de leitura abertas nas orientações efectivos e invertidas. </li></ol> 12. Peptide Quantificação Calcular as áreas de pares pesados ​​e leves de MS1 extraído íon cromatogramas (áreas de pico MS1) e peptídeo sinal-ruído (S / N) proporções 10. Incluir pares de peptídeos somente quando sua média de sinal-noiproporção se for superior a cinco. Quantificar a abundância relativa de um peptídeo das duas amostras como a razão entre as áreas dos picos de MS1 versões pesadas e leves do mesmo péptido (razão de área de pico MS1). Calcular as abundâncias relativas de proteína como a razão da área do pico MS1 mediana para todos os péptidos da proteína.

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</ol>

Os autores declaram não competindo interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Vários pontos tornar a rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos usando um método atraente para proteômica quantitativa dimetilação redutora (rotulagem Redi): reagentes baratos de rotulagem (reagentes custam menos de US $ 1 por amostra), a taxa de reação rápida (~ 10 min), ausência de produtos secundários, altas reprodutibilidade (Figuras 3, 4), produtos de reacção estáveis, capacidade de usar qualquer protease, e alta eficiência de ionização de peptídeos identificados. Marcação química por Redi tam...

Medindo diferenças de concentração de muitas proteínas entre as amostras complexas é um desafio central em proteômica. Cada vez mais, isso é feito através da marcação de proteínas de cada uma das amostras com diferentes marcações isotópicas, combinando as amostras, e por espectrometria de massa para quantificar as diferenças de concentração. Existem vários métodos para a marcação isotópica estável de proteínas e peptídeos. 15N rotulagem 1 e 2 SILAC introduzir marcadores isotópicos metabolicamente in vivo, ao passo que iCAT 3, iTRAQ 4, e redução dimetilação 5 adicionar tags de isótopos estáveis ​​após a extracção de proteína e de digestão. Entre esses métodos, dimetilação redutora (rotulagem Redi) está ganhando popularidade como um método barato e reprodutível para quantificar as diferenças de concentração de proteínas em quase qualquer tipo de amostra. Rotulagem Redi envolve péptidos que reagem com o formaldeído, para formar uma base de Schiff, a qual é então reduzidapor cianoborohidreto. Esta reacção dimethylates grupos amino livres no terminal N e cadeias laterais de lisina e monomethylates prolinas N-terminais. O protocolo aqui descrito metila péptidos em amostra 1 com um rótulo de &quot;luz&quot; usando reagentes com átomos de hidrogénio na sua distribuição isotópica natural e a amostra 2, com um rótulo &quot;pesada&quot; usando formaldeído deuterado e cianoborohidreto (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado sobre um péptido resulta numa diferença de massa de 6,0377 Da entre luz e formas, pesados, que são utilizados para distinguir entre as duas formas, utilizando um espectrómetro de massa. Especificamente, as abundâncias relativas de péptidos são quantificadas como a razão entre as áreas de cromatogramas de iões MS1 extraídos (MS1 razão de área de pico) da luz e da versão pesada para cada par de iões de péptidos. A abundância relativa de uma proteína é calculada como a razão da área do pico MS1 média entre todos os péptidos da proteína. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo robusto para condutaing Redi experiências de marcação por LC-MS/MS, que inclui o péptido de extracção de fase reversa em fase sólida, marcação Redi na coluna, o péptido de fraccionamento por pH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia, e purificação de misturas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Discutimos vantagens e limitações do uso de rotulagem Redi para proteômica quantitativa.

<table><tbody><tr>Precipitação de proteína de <td>ácido tricloroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>Precipitação</td></tr> de <tr>proteína <td>de 650501</td><td>de acetona</td><td>Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>71736</td><td>desnaturar, reduzir a proteína</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>desnaturar, reduzir a proteína</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>desnaturar, reduzir, alquilar proteína</td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Mini Cocktail Completo</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>desnaturar, reduzir a proteína</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>proteína alquilada</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>ressuspender, extrair, rotular proteína</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>ressuspender proteína</td></tr><tr><td>Lysyl Endoprotease</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>digestão de proteínas</td></tr><tr><td>Tripsina de grau de sequenciamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>digestão de proteínas</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>digestão de proteínas</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Extração de peptídeos de fase reversa</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 cartuchos</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td>Extração de peptídeo de fase reversa</td></tr><tr><td>Coletor de extração</td><td>Águas</td><td>WAT200609</td><td>Extração de peptídeo de fase reversa</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>vários</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>" luz" marcação de peptídeo</td></tr><tr><td>Cianoborohidreto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>" luz" marcação de peptídeos</td></tr><tr><td>Formaldeído deuterado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>" pesado" marcação de peptídeos</td></tr><tr><td>Isótopos CDN</td> de<td>cianobororodeuterídeo sódico</td><td>D-1797</td><td>" pesado" marcação de peptídeos</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>coluna de marcação de peptídeos</td></tr><tr><td>C18-HPLC (4,6 x 250 mm, 5 &micro; m tamanho de partícula)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>cromatografia de fase reversa de pH básico</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>vários</td></tr><tr><td>discos C18 Empore</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>Dicas de PALCO</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>dicas STAGE</td></tr></tbody></table>

proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para stable isotope labeling

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Rotulagem isótopo estável de péptidos por dimetilação redutiva (marcação Redi) é um método para quantificar com precisão as diferenças entre as amostras de expressão de proteínas utilizando espectrometria de massa. Rotulagem Redi é realizada usando regular (luz) ou deuterados formas (pesados) de formaldeído e sódio cianoborohidreto para adicionar dois grupos metil para cada amina livre. Aqui demonstramos um protocolo robusto para a rotulagem Redi e comparação quantitativa de misturas complexas de proteínas. As amostras de proteínas para comparação são digeridas em péptidos, rotuladas para transportar a luz ou etiquetas de metilo pesados, misturados, e co-analisados ​​por LC-MS/MS. Abundância relativa de proteína são quantificados por comparação de áreas de pico do cromatograma de iões de versões marcadas pesadas e leves do péptido constituinte extraído da MS espectro completo. O método descrito aqui inclui a preparação de amostras por extração em fase sólida de fase reversa, Redi rotulagem na coluna de peptídeos, peptídeos fracionamento por rev básico pHfase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip purificação peptídica. Discutimos vantagens e limitações de rotulagem Redi em relação a outros métodos de incorporação de isótopos estáveis. Destacamos novas aplicações usando rotulagem Redi como um método rápido, barato e preciso para comparar a abundância de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.

Avaliou-se a exatidão, precisão e reprodutibilidade de rotulagem Redi usando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisados ​​de células inteiras. Primeiro, quantificou o Redi eficiência de marcação de uma mistura de C. phytofermentans lisados ​​de proteína a partir de celulose (pesado marcado, H) e glicose (rótulo de luz, L) culturas. Quando filtrada para uma taxa de falsa descoberta peptídeo 1%, esta amostra continha 11.194 sequências de peptídeos exclusivos com um 98% de efi...

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

O objetivo geral deste procedimento é comparar as concentrações de muitas proteínas entre amostras por espectrometria de massa utilizando proteômica pronta. Isso é realizado primeiramente digerindo a proteína de cada amostra para gerar misturas de peptídeos. Em seguida, as duas amostras são misturadas, e os peptídeos na amostra combinada são fracionados e dessalinizados.Em seguida, a amostra mista é analisada por espectrometria de massa. Por fim, os peptídeos são identificados comparando-se os dois espectros de MS com uma base de dados alvo e decoy de todos os peptídeos potenciais nas amostras, e a abundância relativa dos peptídeos entre as amostras é quantificada. Em última análise, a proteômica pronta permite a quantificação da abundância relativa de muitas proteínas entre amostras complexas.As principais vantagens da desmetilação redutiva em comparação com outros métodos de marcação com isótopos estáveis, como o iLite, são que o método é rápido, econômico e preciso, não exigindo um meio sintético específico ou condições especiais, o que significa que pode ser aplicado a quase qualquer tipo de amostra. Para começar, prepare um miligrama de proteína celular e 500 microlitros utili

quantitative-proteomics-using-reductive-dimethylation-for-stable

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

13 C-isótopo rotulagem é uma técnica útil para determinar o metabolismo da célula central para vários tipos de microorganismos. Depois que as células foram cultivadas com um substrato específico rotulados, GC-MS medição pode revelar vias metabólicas funcionais com base em padrões de rotulagem única no proteinogénicos aminoácidos.

Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Nível de espécies reativas de oxigênio é elevado quando as células encontrar condições de estresse. Aqui mostramos o exemplo de 3'-3 'diaminobenzidina coloração, bem como cysTMT rotulagem e espectrometria de massa para traçar o perfil do proteoma redox...

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

Dois métodos para atribuir os sinais de ressonância magnética nuclear de α e ε-dimetilamina de uma lisina N-terminal 13C-metilada redutora são descritos. Um método utiliza a seletividade induzida pelo pH da reação de metilação redutiva e o outro usa aminopeptidase para remover seletivamente a lisina N-terminal.

Métodos para identificar as ressonâncias de RMN da amina N-terminal 13C-dimetil em proteínas metiladas redutivamente

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Aqui, apresentamos a quantificação imparcial de ocupação acetilação e/ou succinylation proteína site-specific (estequiometria) de um proteome inteira através de uma análise ratiometric de modificações endógenas às modificações introduzidas após quantitativa química acilação usando anidridos rotulado de isótopo estáveis. Em combinação com a espectrometria de massa sensível aquisição de dados independente, obtêm-se medições de ocupação do local exato.

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.

Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido

A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.

Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

A oxidação do tiol proteico tem implicações significativas em condições fisiológicas e fisiopatológicas normais. Descrevemos os detalhes de um método proteômico redox quantitativo, que utiliza captura assistida por resina, marcação isobárica e espectrometria de massa, permitindo a identificação e quantificação específicas do local de resíduos de cisteína oxidada reversivelmente de proteínas.

Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

Este artigo descreve um método de preparação amostral baseado na inativação de calor para preservar peptídeos endógenos evitando a degradação pós-morte, seguido de quantitação relativa usando rotulagem isotópica mais LC-MS.

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Aprenda proteômica quantitativa por espectrometria de massa usando marcação por dimetilação redutiva (ReDi). Este método rápido e econômico permite quantificar proteínas em amostras complexas com alta precisão.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

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