Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar
15 de outubro de 2010
Este protocolo discute a dissecção ao vivo de Drosophila Larvas com a finalidade de imagens do movimento da GFP tag vesículas axonal em pistas de microtúbulos.
Para estudar se existem defeitos no transporte axonal de longa distância em doenças neurológicas, como a doença de Alzheimer ou a doença de Huntington. O transporte axonal de vesículas de transporte é visualizado em larvas esofágicas vivas. Aqui, indaga-se.
Larvas de terceiro estágio que expressam uma proteína física marcada com GFP são dissecadas sobre um cubo de gel, e então transferidas para o microscópio para imageamento in vivo. A microscopia de fluorescência é então utilizada para rastrear o transporte físico dentro do axônio. A principal vantagem do uso desta técnica em comparação com métodos existentes é a visualização do movimento vivo e ininterrupto de vesículas sinápticas e axônios larvais.
Prepare-se para a dissecação garantindo que os seguintes materiais e reagentes estejam à mão. Tampão de dissecação. Um cubo de Sill guard cortado com uma polegada de largura, uma polegada de comprimento e um centímetro de altura, colocado sobre uma lâmina de vidro.
Pinças de dissecação extra curtas. A parte inferior afiada das pinças manum é a mais adequada para dissecação. O comprimento correto pode ser obtido inserindo pinças mais longas no gel e cortando qualquer parte da pinça que sobressair.
Você também precisará de um par de tesouras de mola para microdissecção afiadas e dois conjuntos de pinças de ponta fina. Use uma espátula metálica pequena para transferir larvas de terceiro instar em estágio de erradiação que expressem uma proteína SLE marcada com GFP para uma placa de Petri.
Em seguida, aplique água desionizada sobre as larvas na placa de Petri para remover todo o alimento. Depois, com pinça, transfira-as para um cubo de gel para dissecação a fim de realizar a dissecação em vivo. Use a pinça para transferir uma larva para o cubo de gel de dissecação.
Em uma lâmina de vidro, adicione tampão de dissecação à lâmina para imergi-la. Em seguida, prenda a larva nas extremidades anterior e posterior com o lado dorsal voltado para cima. Usando tesoura de microdissecação, faça um pequeno corte na linha média próxima à extremidade posterior.
A partir dessa incisão, faça outro corte até a região anterior. Os intestinos e os corpos gordurosos sairão com o auxílio de dois alfinetes. Fixe a cutícula cortada nas bordas laterais ao cubo de suporte de silício.
Use uma pipeta para adicionar uma gota de tampão de dissecação. Em seguida, com uma pinça, remova cuidadosamente os intestinos do intestino e os corpos gordurosos. Aplique uma toalha de papel kim em um dos lados da larva para remover o tampão, enquanto simultaneamente adiciona tampão de dissecação fresco com uma pipeta.
A lava nunca deve estar seca. Para marcar estruturas mitocondriais ou lisossomais na lava, substitua o tampão de dissecação por tampão de dissecação contendo mito tracker ou lyo tracker. Coloque o cubo de dissecação em uma câmara quadrada umidificada e cubra com folha de alumínio.
Incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação do marcador in vivo, remova repetidamente o tampão de dissecação ao redor das larvas e adicione mais tampão de dissecação com uma pipeta. Repita este procedimento cinco vezes para remover qualquer marcador remanescente.
Após substituir a última lavagem, empurre completamente os pinos para dentro do suporte S e coloque imediatamente uma lamínula para evitar o movimento da larva. A larva está agora pronta para observação para realizar imagem em tempo real da larva dissecada. Coloque a amostra sobre a platina de um microscópio invertido para imagens de vesículas marcadas.
Nos nervos segmentares larvais. Realize a aquisição de imagens usando uma objetiva de 100 vezes. Se a marcação com GFP for robusta, pode-se observar os corpos celulares no ganglio ventral; os nervos segmentares são analisados usando um sistema de dupla visualização com filtros para C-F-P-Y-F-P ou R-F-P-Y-F-P e software de divisão de imagem, permitindo visualizar simultaneamente duas proteínas marcadas in vivo.
Nesta série de imagens com intervalo de tempo, há muitas vesículas axonais em várias trilhas axonais dentro de um nervo segmentar larval. Observe que a GFP que representa acúmulos axonais também mostra o movimento bidirecional das vesículas. Aqui, é possível observar o movimento de vesículas axonais em uma única trilha dentro de um nervo segmentar larval.
Observe que o movimento bidirecional desses sles é, em média, um mícron por segundo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma dissecação limpa para a visualização in vivo de vesículas marcadas com GFP e axônios larvais gsof.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a dissecação de larvas vivas de Drosophila para a obtenção de imagens do movimento de vesículas axonais marcadas com GFP ao longo de trilhos de microtúbulos. Esta técnica permite a visualização do movimento vivo e ininterrupto de vesículas sinápticas dentro dos axônios larvais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- O transporte axonal é essencial para a função neuronal.
- Defeitos no transporte axonal estão associados a doenças neurológicas.
- As larvas de Drosophila servem como organismo modelo para o estudo desses processos.
- A microscopia de fluorescência permite a observação em tempo real do movimento de vesículas.
Objetivo do Estudo
- Investigar defeitos no transporte axonal de longa distância.
- Compreender as implicações desses defeitos em doenças neurológicas.
- Utilizar técnicas de imagemagem em tempo real para observação aprimorada.
Métodos Utilizados
- Dissecação de larvas de Drosophila expressando proteínas marcadas com GFP.
- Transferência das larvas dissecadas para um cubo de gel para estabilização.
- Imageamento in vivo utilizando microscopia de fluorescência.
- Rastreamento do transporte de vesículas dentro dos axônios.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida do transporte axonal em larvas vivas.
- Demonstração do movimento de vesículas marcadas com GFP.
- Informações sobre a dinâmica do transporte de vesículas sinápticas.
- A comparação com métodos existentes destaca as vantagens desta abordagem.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para o estudo do transporte axonal.
- A imagem em tempo real revela informações essenciais sobre a função neuronal.
- Este método pode ser aplicado para investigar diversas condições neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a dinâmica do transporte axonal é essencial para reduzir os riscos associados a alvos de doenças neurodegenerativas, pois defeitos no tráfego de vesículas estão mecanicamente ligados ao Alzheimer, Huntington e ELA. Este modelo de axônio de larva de Drosophila permite a visualização em tempo real do movimento de vesículas sinápticas, fornecendo um sistema preditivo e relevante para doenças, útil na validação precoce de alvos e na obtenção de insights mecanicistas. Ao quantificar o fluxo bidirecional de vesículas e as taxas de transporte, o método apoia decisões de avançar ou não avançar em programas pré-clínicos focados na integridade axonal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da visualização do transporte de vesículas marcadas com GFP-APP ou sinaptotagmina em axônios vivos.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da observação direta da dinâmica de vesículas em um sistema geneticamente manipulável.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao associar defeitos no transporte à disfunção neuronal em modelos de doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas axonais validados para triagem de compostos ao estabelecer a motilidade basal de vesículas sob condições fisiológicas.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis do movimento de vesículas (por exemplo, fluxo bidirecional de 1 µm/s) para padronização de ensaios.
- Valor Estratégico: Permite fluxos de trabalho de imagem escaláveis e compatíveis com plataformas para avaliar os efeitos de compostos no transporte axonal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar defeitos de transporte observados em condições neurodegenerativas humanas.
- Valor Operacional: Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de imagem em tempo real do transporte de vesículas em nervos larvais intactos.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço ao quantificar o resgate ou agravamento do transporte por moduladores candidatos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta a pré-clínico, apoiando a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta, a prontidão de ensaios na triagem e a validação mecanicista nas etapas pré-clínicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da visualização do transporte de vesículas em resposta a perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de protocolos padronizados de dissecação, coloração e aquisição de imagens que geram métricas consistentes de motilidade vesicular.
- Análises: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (velocidade, direcionalidade, fluxo) que permitem comparação entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar defeitos no transporte axonal relevantes para doenças neurológicas humanas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para estudos longitudinais da integridade axonal em múltiplas classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da visualização direta da dinâmica das vesículas sinápticas.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de condições definidas de tampão de dissecção e parâmetros de imagem.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar/não avançar ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas hipóteses sobre transporte axonal.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos com base na eficácia do resgate do transporte em modelos relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, microdissecação e microscopia de fluorescência.
- Depende de microscópio invertido com objetiva de 100x, sistema de dupla visão e conjuntos de filtros apropriados para GFP e outros fluoróforos.
- Necessita padronização do tampão de dissecação, estadiamento das larvas e controles ambientais (câmara umidificada, temperatura).
- As considerações para adaptação incluem a expressão de diferentes cargas marcadas com GFP (por exemplo, mitocôndrias, lisossomos) por meio de promotores GAL4 neuronais.
- As limitações práticas incluem o tempo de preparo das larvas e a janela de 2–3 horas para transporte robusto de vesículas após a dissecação.
