Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Estudar se defeitos no transporte axonal de longa distância estão presentes em doenças neurológicas, como a doença de Alzheimer ou a doença de Huntington. O transporte axonal de vesículas de transporte é visualizado em lava esofágica viva. Aqui me perguntando.

As larvas em terceira estrela que expressam uma proteína física marcada com GFP são dissecadas em um cubo de gel e, em seguida, transferidas para o microscópio para imagens in vivo. A microscopia de fluorescência é então usada para rastrear o transporte sical dentro do axônio. A principal vantagem de usar essa técnica em relação aos métodos existentes é visualizar o movimento ininterrupto ao vivo de vesículas sinápticas e axônios larvais.

Prepare-se para a dissecação, certificando-se de que os seguintes suprimentos e reagentes estejam à mão. Tampão de dissecação. Um cubo de proteção de peitoril cortado com uma polegada de largura, uma polegada de comprimento e um centímetro de altura colocado em uma lâmina de vidro.

Pinos de dissecação extra curtos. A parte inferior afiada dos pinos de manum funciona melhor na dissecação. O comprimento correto pode ser obtido inserindo pinos mais longos no gel e cortando qualquer parte do pino que se projete.

Você também precisará de um par de tesouras de mola de microdissecção afiadas e dois conjuntos de pinças de ponta fina. Use uma pequena espátula de metal para transferir a errância. Terceiro em larvas estrela expressando A proteína LES marcada com GFP em uma placa de Petri.

Em seguida, aplique água deionizada nas larvas na placa de Petri para se livrar de todos os alimentos. Em seguida, usando uma pinça, transfira-os para um cubo de gel dissecante para realizar a dissecação ao vivo. Use uma pinça para transferir uma larva para o cubo de gel de dissecação.

Em uma lâmina de vidro, adicione um tampão de dissecação à lâmina para mergulhá-la. Em seguida, prenda a lava nas extremidades anterior e posterior com o lado dorsal para cima. Usando uma tesoura de microdissecação, faça um pequeno corte na linha média perto da extremidade posterior.

A partir desta incisão, faça outro corte na anterior. Os intestinos intestinais e os corpos gordurosos escorrem usando dois pinos. Fixe a cutícula cortada nas bordas laterais ao cubo de proteção sil.

Use uma pipeta para adicionar uma gota de tampão de dissecação. Em seguida, usando uma pinça, remova cuidadosamente o intestino, intestinos e corpos adiposos. Aplique um lenço kim em um lado da lava para remover o tampão e, ao mesmo tempo, adicione um novo tampão de dissecação com uma pipeta.

A lava nunca deve estar seca. Para rotular estruturas mitocondriais ou lisossômicas na lava, substitua o tampão de dissecação por um tampão de dissecação contendo mito tracker ou lyo tracker. Coloque o cubo de dissecação em uma câmara quadrada umidificada e cubra-o com papel alumínio.

Incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação do marcador in vivo, absorva repetidamente o tampão de dissecção ao redor das larvas e adicione mais tampão de dissecção com uma pipeta. Repita isso cinco vezes para lavar qualquer marcador restante.

Depois de recolocar a última lavagem, empurre os pinos completamente na proteção S e coloque imediatamente uma lamínula para evitar o movimento da larva. A larva agora está pronta para observação Para realizar imagens ao vivo da lava dissecada. Coloque a amostra no palco de um microscópio invertido para obter imagens de vesículas marcadas.

Dentro dos nervos segmentares larvais. Realize imagens usando uma lente objetiva 100 vezes. Se for observada coloração robusta de GFP nos corpos celulares na imagem do gânglio ventral, os nervos segmentares usando um sistema de visão dupla com filtros para CFPY ou RFY e software de visão dividida duas proteínas marcadas in vivo podem ser visualizadas simultaneamente.

Nesta série de lapso de tempo estão muitas vesículas axonais em muitas trilhas axonais dentro de um nervo segmentar larval. Observe que a GFP que representa acúmulos axonais também observa o movimento bidirecional das vesículas. Aqui, o movimento das vesículas axonais em uma única pista dentro de um nervo segmentar larval é visto.

Observe que o movimento bidirecional desses sles é, em média, um mícron por segundo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como concluir uma dissecção limpa para visualização in vivo de vesículas marcadas com GFP e axônios larvais gsof.