Name: Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a visualizar vesículas sinápticas em axônios de larvas de Drosophila usando microscopia de fluorescência in vivo. Este método permite estudar o transporte axonal em tempo real para pesquisas em neurociência.

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SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation. MK foi apoiado por um Student Research Award por Curca na UB.

1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare a preparação buffer de dissecção, adicionando os seguintes compostos: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mM KCl, HEPES 5mM, sacarose e 36 mM em 1000 mL PH, para 7,2 e filtro de esterilizar. </li></ol> 2. Preparação para o Dissection <ol><li> Cubo Siligard: O gel é cortado para cerca de uma polegada de largura, 1 cm de comprimento e cerca de um centímetro de altura. O cubo de gel é colocado numa lâmina de vidro durante a dissecção. Cubos podem ser usados ​​mais de uma vez. </li><li> Pinos: Pinos usados ​​para dissecção precisa ser mais curta. A parte inferior afiada de pinos minutien funciona melhor na dissecção. </li><li> Precisa de uma tesoura afiada primavera microdissecção. </li><li> Precisa de duas pinças de ponta fina. </li></ol> 3. Coleta de larvas <ol><li> Wandering 3 de larvas que são expressão de uma proteína GFP vesícula tagged são coletados em uma placa de Petri. </li><li> As larvas são lavados em água deionizada para se livrar de todos os alimentos. </li></ol> 4. Dissecção ao vivo de larvas <ol><li> A larva é transferido para o cubo gel dissecção numa lâmina de vidro. Larva é imerso em tampão dissecção. </li><li> Larva é pined no anterior e posterior com dois pinos de bem com o lado dorsal para cima. </li><li> Com uma tesoura de microdissecção, um pequeno corte é feito na linha média, perto da extremidade posterior. A partir desta incisão um corte é feito através do anterior. Usando dois pinos, pino a cutícula corte nas bordas laterais. </li><li> Adicionar uma gota de dissecar buffer. Remova cuidadosamente o intestino, intestinos e órgãos de gordura com uma pinça. A maioria destes tecidos normalmente exsudado durante o corte dorsal. </li><li> Substitua o tampão com tampão dissecar fresco. A larva nunca deve ser seco e deve ser constantemente em dissecar buffer. </li><li> Incubações utilizando marcadores em MitoTracker vivo ou Lyso Tracker é feito neste momento, diluindo-se no marcador o vivo em tampão dissecção. Após a incubação da vivo no marcador lavar a larva dissecados várias vezes (5 lava rápido) usando tampão dissecar fresco. </li><li> Depois de substituir a última lavagem empurrar os pinos para o syligard e imediatamente lamela. As larvas está agora pronto para observação. </li></ol> 5. Imagens ao vivo de larvas dissecadas <ol><li> Coloque a lamela e gel para o palco microscópio e imagem usando um microscópio invertido. </li><li> Nós usamos uma lente de 100x para vesículas imagem marcada dentro larval nervos segmentares. GFP expressão no corpos celulares do gânglio ventral é o primeiro avaliado antes de nervos segmentares são gravadas. Se a coloração GFP robusta é observada em corpos celulares no gânglio ventral, os nervos são, então, fotografado e usado para avaliação. </li><li> Utilizando um sistema de visualização dupla com filtros para CFP / YFP ou RFP / YFP e software de visualização dividida que pode, simultaneamente, duas proteínas com a tag de imagem in vivo. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. A imagem representativa mostrando muitas vesículas axonal em muitas faixas axonal dentro de um nervo segmentar larval Observe as bolhas de GFP, o que representa acúmulo axonal. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: A imagem representativa mostrando uma única faixa axonal com muitas vesículas axonal dentro de um nervo segmentar larval.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Na imagem in vivo de transporte dentro das vesículas sinápticas nervos Drosophila larval segmentar é uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos de transporte axonal. Nós já usou este protocolo para avaliar a dinâmica de transporte dentro nervos larval expressar repete expandiu polyQ para elucidar como a expansão de repetições afeta a dinâmica de transporte vesícula 3. Usando este protocolo a velocidade do movimento das vesículas pode ser determinada pela conversão dos fluxos...

<table><tbody><tr><td>1 Par de Tesouras de Dissecação Microcirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Tesouras de mola &amp;#8211; lâmina de 6 mm. Diâmetro da ponta de 0,125 mm</td></tr><tr><td>2 Pares de Pinças</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pinças Micro-Adson Fisherbrand com ponta serrilhada</td></tr><tr><td>Caixa de Alfinetes de Dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Alfinetes Minutien com diâmetro de 0,1 mm</td></tr></tbody></table>

em visualization vivo das vesículas sinápticas dentro drosophila larval axônios segmentar

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidar os mecanismos de transporte axonal tem se mostrado muito importante na determinação de como defeitos no transporte de longa distância afetam diferentes doenças neurológicas. Defeitos neste processo essencial pode ter efeitos prejudiciais no funcionamento neuronal e desenvolvimento. Nós desenvolvemos um protocolo de dissecação que é projetado para expor os<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval nervos segmentares para ver o transporte axonal em tempo real. Nós adaptamos este protocolo para geração de imagens ao vivo do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996) usado para immunolocalizatin larval de nervos segmentares. Dissecção cuidadosa e condições tampão adequada são essenciais para maximizar a vida útil das larvas dissecadas. Quando feito corretamente, as larvas dissecadas mostraram transporte vesicular robusta por 2-3 horas em condições fisiológicas. Usamos o método UAS-GAL4<sup&gt; 1</sup&gt; Para expressar GFP-tagged APP ou vesículas sinaptotagmina dentro de um único axônio ou axônios muitos larval nervos segmentar utilizando neuronal GAL4 diferentes drivers. Outros marcadores fluorescentes marcados, por exemplo mitochrondria (MitoTracker) ou lisossomos (Lyso Tracker), pode ser aplicado também para as larvas antes de visualizar. GFP vesícula-movimento e movimento de partículas podem ser visualizadas simultaneamente usando comprimentos de onda diferentes.

Este protocolo discute a dissecção ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas com a finalidade de imagens do movimento da GFP tag vesículas axonal em pistas de microtúbulos.

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

A elucidação dos mecanismos de transporte axonal demonstrou ser fundamental para determinar como as falhas no transporte de longa distância afetam diferentes...

Para estudar se existem defeitos no transporte axonal de longa distância em doenças neurológicas, como a doença de Alzheimer ou a doença de Huntington. O transporte axonal de vesículas de transporte é visualizado em larvas esofágicas vivas. Aqui, indaga-se.Larvas de terceiro estágio que expressam uma proteína física marcada com GFP são dissecadas sobre um cubo de gel, e então transferidas para o microscópio para imageamento in vivo. A microscopia de fluorescência é então utilizada para rastrear o transporte físico dentro do axônio. A principal vantagem do uso desta técnica em comparação com métodos existentes é a visualização do movimento vivo e ininterrupto de vesículas sinápticas e axônios larvais.Prepare-se para a dissecação garantindo que os seguintes materiais e reagentes estejam à mão. Tampão de dissecação. Um cubo de Sill guard cortado com uma polegada de largura, uma polegada de comprimento e um centímetro de altura, colocado sobre uma lâmina de vidro.Pinças de dissecação extra curtas. A parte inferior afiada das pinças manum é a mais adequada para dissecação. O comprimento correto pode ser obtido inserindo pinças mais longas no gel e cortando qualquer parte da pinça que so

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Nós descrevemos o procedimento para preparar...

Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de...

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Este vídeo demonstra um protocolo para estudar a reciclagem de vesículas sinápticas em junções neuromusculares em larvas de Drosophila que expressam channelrodopsina usando um corante fluorescente. A luz azul ativa as channelrodopsinas, causando influxo de cálcio e exocitose de vesículas sinápticas. O corante se integra às membranas neuronais e é internalizado durante a endocitose, resultando em maior fluorescência. A estimulação adicional da luz azul induz exocitose e liberação de corante, o...

Analisando a reciclagem de vesículas sinápticas e a absorção de corantes fluorescentes em larvas de Drosophila

Fonte: Jeong, S. Visualização do padrão de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a visualização de projeções axonais em embriões Drosophila. A imunomarcação de neurônios motores, a dissecção precisa para expor estruturas neuronais e a microscopia de contraste de interferência diferencial revelam coletivamente a arquitetura neuronal detalhada, enfatizando os padrões de projeção axonal.

Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Aprenda a visualizar vesículas sinápticas em axônios de larvas de Drosophila usando microscopia de fluorescência in vivo. Este método permite estudar o transporte axonal em tempo real para pesquisas em neurociência.

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

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