Name: Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda microinjeção em embriões de Anopheles stephensi para criar mosquitos transgênicos resistentes à malária. Esta técnica de biologia de vetores auxilia no controle da transmissão da doença.

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Preparação antes da microinjeção: <ol><li> Mosquitos alimentam de sangue: para injeção de segunda a quarta-feira fêmeas alimentam na sexta-feira anterior. Para injetar quinta-feira e sexta-feira, as fêmeas se alimentam de segunda-feira da mesma semana. </li><li> Prepare as agulhas de quartzo usando o programa 2 e tampão isotônica (veja Materiais). </li><li> &quot;Deitado tubo&quot; para os embriões é o frasco de cultura regulares Drosophila. Algodão molhado no fundo, com um disco de papel de filtro molhado cobrindo-o. </li><li> Prepare lamínula de plástico furando a fita dupla face a um fim. Fita guarnição para cobrir deslizamento de modo que termina na borda da lamínula. </li><li> Prepare óleo para dessecação. </li><li> Prepare uma placa de Petri com tampão isotônica para transferir os embriões para incubação. </li></ol> Criação de imposição forçada: <ol><li> Coletar sangue 10/06 fêmeas alimentados com o uso de um aspirador e transferi-los para o frasco de cultura Drosophila com algodão e papel de filtro molhado com tampão isotônica. </li><li> Os mosquitos são então colocados de volta em condições insectery no escuro e permitiu a pôr ovos por 1 hora e 15 min. </li><li> Vamos voar adultos na gaiola e retire o disco de papel filtro com embriões. </li><li> Para alinhar os ovos, fazê-lo no âmbito de dissecação. Coletar cachos de ovos com um pincel fino (Sable, No 0000) e transferir para um quadrado de papel Whatman preparado 3MM embebido com tampão isotônica. Mantenha o papel o tempo todo molhado. Não deixe que os ovos se desidratado. Remover o exocório com o pincel, que ajuda a melhor vara de ovos para a fita. </li><li> Usando pinça fina No. 5 ou um pincel fino, pegar embriões cinza escuro e organizar em linha na praça da Whatman 3MM molhado com tampão isotônica. Line up 20-30 embriões. Todos os embriões devem estar na mesma orientação que a injeção tem que ser no pólo posterior. A extremidade anterior dos embriões é ligeiramente mais largo que o posterior. Em seguida, usando tiras de papel Whatman 3MM, secar o filtro onde os ovos estão alinhados pressionando duro em ambos os lados da linha de ovos, não tocando os ovos. </li><li> Para transferir os ovos, inverter o slide que contém a fita dupla face (Medicina), e pressione suavemente contra os ovos. A extremidade posterior dos ovos tem que ser muito perto da borda da fita dupla face. A umidade do papel é fundamental para isso, se ele estiver muito molhada que não vai aderir. Eu faço dessecação dos embriões a partir de segunda 10/05, mas o tempo dessecação depende da umidade e da temperatura na sala de microinjeção. </li><li> Dessecação é fundamental para os ovos: pouco demais e embriões não chocarão. Sem DNA dessecação não está entrando em embrião. </li><li> Cobrir com óleo de embriões dessecados halocarbono prevenir o dessecamento mais. </li></ol> Microinjeção de embriões: O aspecto mais importante da injeção de bom é a qualidade da agulha (ver nota). <ol><li> Preencher uma agulha com a solução de DNA a ser injetado através de um microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Muito soliution injeção pouco é necessário, 1 a 2 ml. </li><li> Conecte a agulha para a Transjector Eppendorf, que controla o tempo de injeção e pressão, bem como a contrapressão. Microinjeção é realizada utilizando um microscópio com um palco em movimento (Leica) na ampliação x 10 e micromanipulador (Leica). Se necessário, um estágio do microscópio levantadas podem ser preparados pelo empilhamento de lâminas de microscópio 4-5. Coloque a lamínula carregando os embriões em estágio elevado. Embriões são injetados em um ângulo de 150; penetração deve ser no pólo posterior. Injectável, eu continuo a agulha estacionário e move o estágio do microscópio. Quando a agulha é nova, a dica é fechado e geralmente quebra na primeira injeção. Eu sempre trabalho com a pressão necessária para expulsar uma pequena gota de DNA em óleo entre cada injeção. </li><li> Eu definir o tempo de injeção para 0,2-0,9 sec e 1000 hPa quando a agulha é nova. Eu variar a pressão e tempo até que uma pequena gota é visto saindo da agulha no óleo. A contrapressão deve ser definido em torno de 100. Como a ponta da agulha fica gasta, a pressão de injeção deve ser reduzida para manter o baixo volume de injeção (cerca de 300 hPa). Após isso, a ponta da agulha é muito grande e está matando a maioria dos embriões, o. </li><li> Após a injeção, retire o óleo com papel de seda e cobrir a lâmina com embriões e coloque no prato de Petri com tampão isotônica. Coloque os pratos na insectory e deixá-los lá até os embriões hatch. Eles começam a eclodir após 2-6 dias. Transferência das larvas para água destilada com a pitada de comida de peixe chão. </li></ol> Notas DNA injectável: solução de DNA plasmidial para injeção foi isolado utilizando kit plasmídeo EndoFree.Construção de plasmídeo e misture Helper plasmídeo juntos em concentração correta, precipitado com isopropanol. O pellet foi lavado com etanol 70% antes de ressuspender em tampão de injeção. Antes da injeção, usando DNA limpa Millex-GV coluna. Tampão Izotonic: <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 896 ml </td><td> OR </td><td> 5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 Hepes M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml </td></tr></tbody></table> Ajustar o pH 7,2

<table><tbody><tr><td>Agulhas de quartzo para injeção</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>São preparadas com diâmetro externo de 1,0 mm, diâmetro interno de 0,70 mm e comprimento de 10 cm, puxando tubos capilares para formar uma ponta fina de 3-8 µm com um eixo de aproximadamente 100-300 mm no puxador de micropipetas.</td></tr><tr><td>Puxador de quartzo</td><td>Ferramenta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>Configuração: Calor-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141</td></tr><tr><td>Kit de plasmídeo EndoFree</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna Millex-GV</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>para limpeza de DNA</td></tr><tr><td>Construto de DNA</td><td></td><td></td><td></td><td>0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Plasmídeo auxiliar</td><td></td><td></td><td></td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>Solução de injeção</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Solução 1x: 5 mM KCl, 0,1 mM fosfato de sódio, pH 6,8</td></tr><tr><td>Tampão isotônico</td><td></td><td></td><td></td><td>ver receita na seção do protocolo</td></tr><tr><td>Óleo de dessecação</td><td></td><td></td><td></td><td>Óleo Halocarbono 700:Óleo Halocarbono 27 (1:1). Misturar bem. Preparar com antecedência da microinjeção.</td></tr><tr><td>Sangue</td><td></td><td></td><td></td><td>para alimentar mosquitos</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Mosquitos, machos e fêmeas.</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de Drosophila</td><td></td><td></td><td></td><td>para postura de ovos</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>com tampão isotônico, para eclosão de embriões</td></tr><tr><td>Pincel fino</td><td></td><td></td><td></td><td>Sable nº 0000</td></tr><tr><td>Papel Whatman 3MM</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça nº5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjetor</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>com platina móvel e micromanipulador, ajustado em 10x de magnificação</td></tr></tbody></table>

uma injeção de. embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

A introdução de genes exógenos em genomas de mosquitos exige técnicas de microinjeção sob medida para as espécies de interesse específicos. Este protocolo de vídeo demonstra um método utilizado pelo laboratório de James para microinject constrói DNA em embriões de Anopheles stephensi para a geração de mosquitos transformada. Técnicas de preparação agulhas microinjeção, coleta e preparação de embriões e na execução da microinjeção são ilustradas.

Mosquitos Anopheles stephensi são vetores da malária e da Índia que habitam em toda a Ásia. Este vídeo demonstra a técnica para a realização de microinjeções desta espécie com transgenes que conferem resistência à malária para o mosquito. Grande parte da metodologia demonstrada neste vídeo é aplicável às técnicas de microinjeção de outras espécies de mosquito.

Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

A introdução de genes exógenos nos genomas de mosquitos requer técnicas de microinjeção adaptadas à espécie específica de interesse. Isso...

A cada 15 segundos, uma criança morre de malária no mundo; aqui, no laboratório de James, estamos tentando criar mosquitos franceses que não possam transmitir o parasita da malária. Meu nome é TIUs. Estou aqui na Universidade da Califórnia, em Irvine, no Departamento de Biologia Molecular e Bioquímica, no laboratório de Anthony James.Hoje vou mostrar a vocês como produzir olhos transgênicos e não Stevens. Estamos fazendo isso para tornar os mosquitos resistentes à malária, de modo que não possam carregar o parasita da malária. Preparei um frasco com tampão isotônico onde os mosquitos irão depositar seus ovos.Vou usar este aspirador para coletar os mosquitos e colocá-los em um frasco. Este frasco será então colocado em uma incubadora a 30 graus Celsius, onde permanecerá por cerca de uma hora em um copo. Agora vamos preparar as agulhas de microinjeção.Essas são agulhas feitas de quartzo e precisamos usar uma ponta muito fina. Portanto, precisamos desse puxador de agulhas. Utilizamos um puxador de agulhas da Suter Instruments e também as agulhas da Subtle in SU Instruments.Agora, retirando os mosquitos, colocarei esses ovos em uma placa de Petri contendo um papel-filtro embebido em ta

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório de James para injetar dsRNA em fêmeas de mosquitos A. aegypti, que abrigam o vírus da dengue. A técnica para a calibração de agulhas de injeção, manipulando a configuração da injeção, e injetando dsRNA no tórax é ilustrado.

Injeção de dsRNA em Mosquitos Feminino A. aegypti

Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

Nesta entrevista, George Dimopoulos enfoca os mecanismos fisiológicos utilizados pelos mosquitos para combater o Plasmodium falciparum e infecções por vírus dengue. Explicação é dada de como principais genes refratários, os genes que conferem resistência a patógenos vetor, são identificados no mosquito e como este conhecimento pode ser usado para gerar mosquitos transgênicos que são incapazes de transportar o parasita da malária ou dengue.

Construção de uma melhor Mosquito: identificar os genes habilitação Malária e Dengue Febre Resistência em A. gambiae e A. aegypti mosquitos

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos...

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Neste vídeo, demonstramos a integração de transgenes específicos do local mediada por phiC31 no embrião de Anopheles por meio de microinjeção. Este método ajuda a introduzir os genes desejados em um sistema hospedeiro para pesquisa e aplicações industriais.

phiC31-Integração de transgene dirigida ao local mediada por integrase: uma técnica de microinjeção para integração de transgene específico do local em um vetor de Anopheles

Neste vídeo, demonstramos a entrega da construção do gene drive no embrião do mosquito Anopheles gambiae por meio da técnica de microinjeção de embriões. Este procedimento permite a integração da construção de DNA entregue, por meio de recombinação homóloga, nas células germinativas para gerar uma população de mosquitos transformada.

Microinjeção de embrião de mosquito: uma técnica para entregar DNA exógeno na gema embrionária de Anopheles gambiae para gerar mutações germinativas

O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

O protocolo descreve como alcançar modificações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos anofelinos da malária usando o sistema φC31 . As modificações descritas incluem tanto a integração quanto a troca de fitas transgênicas no genoma das linhas de acoplamento de rolamento attP.

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Técnicas de microinjeção são essenciais para introduzir genes exógenos nos genomas dos mosquitos. Este protocolo explica um método usado pelo laboratório James para microinjetar construções de DNA em embriões Anopheles gambiae para gerar mosquitos transformados.

Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae

A malária é transmitida através da inoculação do estágio de esporozoíto do Plasmodium por mosquitos infectados. O Plasmodium Transgênico nos permitiu compreender melhor a biologia da malária e contribuiu diretamente para os esforços de desenvolvimento de vacinas contra a malária. Aqui, descrevemos uma metodologia simplificada para gerar esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei .

Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para edição do genoma por meio de microinjeção embrionária no mosquito A. aegypti usando a tecnologia CRISPR-Cas9.

Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

Aprenda microinjeção em embriões de Anopheles stephensi para criar mosquitos transgênicos resistentes à malária. Esta técnica de biologia de vetores auxilia no controle da transmissão da doença.

Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

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