Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

A cada 15 segundos, uma criança morre de malária no mundo; aqui, no laboratório de James, estamos tentando criar mosquitos franceses que não possam transmitir o parasita da malária. Meu nome é TIUs. Estou aqui na Universidade da Califórnia, em Irvine, no Departamento de Biologia Molecular e Bioquímica, no laboratório de Anthony James.

Hoje vou mostrar a vocês como produzir olhos transgênicos e não Stevens. Estamos fazendo isso para tornar os mosquitos resistentes à malária, de modo que não possam carregar o parasita da malária. Preparei um frasco com tampão isotônico onde os mosquitos irão depositar seus ovos.

Vou usar este aspirador para coletar os mosquitos e colocá-los em um frasco. Este frasco será então colocado em uma incubadora a 30 graus Celsius, onde permanecerá por cerca de uma hora em um copo. Agora vamos preparar as agulhas de microinjeção.

Essas são agulhas feitas de quartzo e precisamos usar uma ponta muito fina. Portanto, precisamos desse puxador de agulhas. Utilizamos um puxador de agulhas da Suter Instruments e também as agulhas da Subtle in SU Instruments.

Agora, retirando os mosquitos, colocarei esses ovos em uma placa de Petri contendo um papel-filtro embebido em tampão isotônico, o que serve apenas para manter os embriões úmidos durante o período de injeção. A quantidade de água no papel-filtro é crítica. Você não quer que os ovos flutuem, nem que sequem.

Agora vou transferir o embrião do papel do ovo para outro papel Watman de três mm que foi umedecido com tampão isotônico. Faço isso para remover o córion antes de alinhar os embriões para a microinjeção. Agora vou remover o córion, que é essa superfície prateada dos ovos.

E faço isso escovando-os com minha escova. Então, na parte superior aqui temos um embrião onde o córion ainda está presente e eles têm essa parte prateada e brilhante. Onde está o da parte inferior?

Consegui remover com sucesso o Corian e este de cima provavelmente deslizará sobre uma fita, enquanto o de baixo aderirá. E isso é o que importa quando se trabalha com lados desiguais. Agora estou alinhando os embriões.

Os embriões são maiores na extremidade anterior, e é essa extremidade que estou posicionando à direita. À esquerda, tenho a extremidade posterior, que é mais fina e onde injetarei os embriões. Estou tentando posicioná-los juntos para que se ajudem a permanecer em posição.

E normalmente faço cerca de 10 em uma linha juntos. Agora tenho uma linha com os embriões, que vou transferir para uma lamínula. Sobre a lamínula.

Coloco fita adesiva para perucas para que eles fiquem fixados. Quando termino isso, seco o papel de filtro onde os embriões estão posicionados com outro papel de filtro, coloco os embriões sobre a lamínula e deixo secar por 30 segundos antes de aplicar o óleo. Agora alinhamos os embriões e os temos sob o óleo.

No estágio do microscópio, injetaremos DNA misturado com corante alimentar usando esta ponta especial do padrão de micróbios e injetaremos esta mistura nas agulhas da porta. Agora preenchemos a agulha e a recolocamos no microinjetor. E agora estamos prontos para realizar as microinjeções.

Agora estou movendo a agulha para afiá-la e, assim, posso vê-la focada. Após isso, movo a agulha de peso e posiciono os embriões, focando-os também. E quando isso estiver concluído, movo novamente a agulha até posicioná-la corretamente e avanço para os meus embriões.

Agora, quando a agulha atravessa o óleo, ela fica desfocada e você precisa ajustá-la novamente. Então, isso é exatamente tubarão. Exatamente, carrapato de tubarão.

E agora estou pronto para realizar as injeções. Dá para ver que toquei o embrião com a agulha, e ao fazer isso quebrei a ponta, e é possível observar uma pequena gota saindo, que será injetada no embrião. Então, aqui injete e retire novamente.

E verifico a cada vez, entre cada embrião, se há uma pequena gota saindo na ponta da agulha. E, como é possível observar, preciso reajustar a posição para cada embrião, a fim de obter uma posição perfeita. Agora, este estava vazando.

Como você pode ver, quando faço minha segunda injeção no óleo, a bolha torna-se muito grande e preciso reajustar a pressão do microinjetor. Agora terminamos as microinjeções e vamos transferir os embriões do microscópio para a placa de Petri, que preenchemos com tampão isotônico. Vou remover o óleo da lamínula e cortá-la em um pequeno pedaço, que colocarei dentro da placa de Petri.

Agora vamos deixá-los aqui até o final do dia, à temperatura ambiente. Em seguida, transferimos para o insetário. Hoje eu mostrei como injetar um ovário de Stevin para produzir mosquitos transitórios.

E agora precisamos apenas esperar que as larvas eclosionem completamente. Vamos criá-las até a fase adulta e, em seguida, elas acasalarão. Depois disso, teremos três semanas antes de podermos iniciar um teste para verificar se são Refactor ou não.