Name: Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a caracterizar complexos multiproteicos de lisados celulares usando eletroforese em gel de poliacrilamida azul nativo (BN-PAGE). Esta técnica bidimensional preserva interações proteicas nativas para análise precisa.

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Agradecemos a Michael Reth, Hermann Schägger, e Margarita Camacho-Carvajal ao apoio científico. Este trabalho foi financiado pela Forsys do fuer Bundesministerium Bildung e Forschung (BMBF), pela BIOS do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), e apoiado em parte pela Iniciativa de Excelência dos Governos Federal e Estadual alemães (GSC-4, Spemann Graduate School ).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo, descrevemos a análise do PPM pelo BN-PAGE. Uma abordagem 2D é usada para separar primeiro PPM em condições nativas e, depois, subdividir-los em seus componentes individuais, uma segunda dimensão SDS-PAGE. As amostras são preparadas a partir de lisados ​​celulares. Para a solubilização do PPM muitos, um detergente apropriado é necessário, que preserva a estrutura dos complexos de proteína. Aqui, usamos 0,1% Triton X-100. No entanto, o detergente ideal e adequada a sua concentração tem que ser determinado empiricamente para cada MPC. Em caso de Triton X-100, por exemplo, foi relatado que as concentrações de detergente permitir a identificação de uma forma dimérica da F 1 F 0-ATPase complexos (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Maior Triton X-100 concentrações, no entanto, levam à dissociação do dímero e um aumento correspondente do monomérica F 1 F 0-ATPase complexo. Isto está de acordo com um dos nossos estudos anteriores, nós mostramos que foram o complexo receptor de células T multivalentes (TCR) é preservada quando extraído com baixas concentrações de Brij 96, enquanto que o uso de maior concentração ou de outro detergente chamado resultados digitonina em a extração de monomérica TCR (Schamel, Aréchaga et al. 2005). Detergentes comumente usados ​​que podem ser testados incluem digitonina (0,5 a 1%), Triton X-100 (0,1 a 0,5%), Brij 96 (0,1 a 0,5%), ou dodecylmaltoside (0,1 a 0,5%). Estes reagentes são os detergentes não-iônico, que tendem a ser melhor para a estabilidade MPC. Esteja ciente de que o contato com SDS e outros detergentes fortes devem ser evitados (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Diálise do lisados ​​é necessário para alcançar MPC separação em um BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. Parece que o ajuste da concentração de sal ou a remoção de impurezas de baixo peso molecular é crucial em alta resolução. Vale ressaltar que também preparações de membrana e PPM, que têm sido immunopurified e, posteriormente, eluída da anticorpos, são adequados para BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). Em ambos os casos, as amostras não precisam ser dialisado para BN-PAGE separação, se lise de membranas ou de eluição é realizada em BN lise-buffer. Para a separação de proteínas por BN-PAGE, o corante Coomassie blue é necessário, que se liga a proteínas não específica e cobre-os com cargas negativas. Assim, Coomassie blue permite a mobilidade eletroforética de proteínas para o catodo de pH neutro (Schägger e von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al 1994).. Além disso, Coomassie blue previne a agregação de proteínas no gel de empilhamento durante a eletroforese. Para BN-PAGE, Coomassie G250 tem que ser usado em vez de azul Coomassie R250 ou blues Coomassie coloidal. Antes de executar um BN-gel, é necessário para garantir que a percentagem de gel se adapta ao tamanho esperado do MPC de interesse. Pré-moldado BN-géis com gradientes diferentes e buffers adequados estão disponíveis comercialmente a partir Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Sistema Gel). Mas BN-gel também pode ser preparado usando um misturador de gradiente, juntamente com uma bomba persistaltic. Para garantir um gradiente intactos, o líquido deve fluir constantemente durante o vazamento e bolhas devem ser evitadas. Recomendamos o carregamento de diferentes diluições de amostras no gel, pois a sobrecarga pode levar à precipitação de proteínas durante o processo de eletroforese. Além disso, BN-gel deve ser executado a 4 ° C para prevenir a degradação de proteínas e para manter o PPM intacta. Depois BN-PAGE visualização, de PPM pode ser alcançado por Coomassie coloração azul brilhante, coloração pela prata ou immunoblotting. Bandas de proteínas visualizados através da coloração Coomassie ou prata são adequados para posterior análise por espectrometria de massa (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Em caso de immunoblotting, as condições de transferência ideal para o PPM de juros têm de ser determinadas empiricamente. Estar ciente de que Coomassie azul também é transferida durante blotting de um BN-gel. Portanto, o gel vai ser incolor após a transferência bem-sucedida, ao passo que a membrana irá exercer uma cor azul. Além disso, é importante mencionar que não todos os anticorpos primários, que trabalha para detecção após SDS-PAGE, é aplicável a immunoblotting sobre BN-PAGE. Pode acontecer que os anticorpos não reconhecem o MPC de interesse porque o seu epítopo está escondido na conformação nativa das proteínas. Para ultrapassar este problema, é possível para desnaturar as proteínas dentro da BN-gel antes da transferência fervendo o gel em breve no 1x tampão de amostra SDS. No nosso exemplo, não submeta o BN-gel diretamente para a detecção de bandas de proteínas. Em vez disso, nós ainda dividiu o BN-PAGE-lisado separados por um segundo dimensiem SDS-PAGE. Na segunda dimensão SDS-gel, as proteínas monoméricas migrar dentro de uma diagonal hiperbólica devido ao gradiente de gel no primeiro e no gel linear na segunda dimensão (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Isto permite a fácil identificação de PPM, uma vez que estão localizados abaixo dessa diagonal hiperbólica. Subcomponentes de um MPC distintos são separados em uma linha vertical na segunda dimensão SDS-PAGE. Componentes que são constituintes do PPM dinstinct vários podem ser identificados em uma linha horizontal de acordo com o tamanho do MPC. No entanto, ele tem que se considerar que vários spots de proteínas que aparecem em uma linha vertical também poderia ser parte de complexos separados que migram na mesma posição em BN-PAGE. A prova final de que eles estão presentes no MPC mesmo pode ser obtido por um ensaio de alteração baseados em anticorpos gel. Neste ensaio, lisado celular é incubada com um anticorpo contra uma proteína representado por um dos pontos identificados antes da BN-PAGE. Isso resulta em uma mudança de todos os PPM que contêm essa proteína para uma maior massa molecular na primeira dimensão. Outras proteínas que são também uma parte destes PPM vai sofrer essa mudança complexos específicos e por isso são fáceis de identificar na segunda dimensão SDS-gel. Não só a composição do PPM podem ser analisados ​​por BN-PAGE, mas também a determinação de sua estequiometria é possível (e Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. Para este fim, um ensaio Namos (nativo baseadas em anticorpos, ensaio de mobilidade shift) pode ser realizada. Como no ensaio de mudança baseadas em anticorpos, gel, os lisados ​​celulares são incubados com anticorpos monoclonais subunidade anticorpos específicos. Isto leva à indução de immunoshifts eletroforética em gel-BN, que permitem a inferência da extensão da mudança na estequiometria do PPM Em conlusion, BN-PAGE é adequado para a identificação de PPM ea determinação de sua composição, tamanho, bem como abundância relativa. Realizada como um ensaio Namos, ela também oferece a possibilidade de determinar a estequiometria de uma MPC certos. Dada a sua aplicabilidade geral, esta técnica é uma ferramenta muito útil para a caracterização de PPM (Dekker, Müller et al 1996).; (Wittig e Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.); (Wittig e Schägger 2009) .

eletroforese em gel de poliacrilamida azul nativo (bn-page) para análise de complexos multiproteicos de lisados ​​celular

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Complexos multiprotein (PPM) desempenham um papel crucial na sinalização celular, já que a maioria das proteínas podem ser encontradas em complexos funcionais ou de regulamentação com outras proteínas (Sali, Glaeser et al. 2003). Assim, o estudo das redes de interação proteína-proteína requer a caracterização detalhada do PPM para ganhar uma compreensão integrativa da função da proteína e regulação. Para a identificação e análise, PPM devem ser separados em condições nativas. Neste vídeo, descrevemos a análise do PPM por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). BN-PAGE é uma técnica que permite a separação de PPM em uma conformação nativa com uma resolução maior que o oferecido por filtração em gel ou ultracentrifugação de densidade de sacarose, e é, portanto, útil para determinar MPC tamanho, composição e abundância relativa (Schägger e von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al 1994).. Por este método, as proteínas são separadas de acordo com seu tamanho e forma hidrodinâmica em uma matriz de poliacrilamida. Aqui, demonstramos a análise do PPM do total lisados ​​celulares, apontando que a diálise lisado é o passo crucial para fazer BN-PAGE aplicável a estas amostras biológicas. Usando uma combinação de primeira dimensão BN e segunda dimensão SDS-PAGE, mostramos que PPM separados por BN-PAGE pode ser subdividida em seus componentes individuais por SDS-PAGE. Visualização dos componentes MPC sobre separação gel é realizada por immunoblotting padrão. Como um exemplo para MPC análise por BN-PAGE, que escolheu o 19S bem caracterizados eucarióticas, 20S, 26S e proteasomas.

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Complexos multiproteicos (CMPs) desempenham um papel crucial na sinalização celular, visto que a maioria das proteínas pode ser encontrada em complexos funcionais ou regulatórios com outras...

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar um complexo MultiPro a partir de lisados celulares utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul, que, ao contrário da PAGE com SDS, permite a separação de proteínas em condições nativas e preserva as interações entre proteínas. Isso é alcançado por meio da diálise do lisado celular para remover sais em excesso, tornando a amostra adequada para separação por PAGE nativa azul como segundo passo. O lisado é aplicado na PAGE nativa azul de primeira dimensão, que separa os complexos proteicos em condições nativas de acordo com seu tamanho e forma.Em seguida, uma segunda dimensão. É realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS desnaturante para subdividir os complexos em seus constituintes individuais. As proteínas podem ser visualizadas por coloração com prata ou com Coomassie ou por western blotting.Aqui, as proteínas separadas foram detectadas por coloração com prata na demonstração a seguir; no entanto, será utilizado o western blot. Olá, sou Brita Bloom do laboratório de Wolfgang Sharmel, do Departamento de Imunologia Molecular no Instituto Max Plank de Imunobiologia em Freiburg, Alemanha. Olá, sou Dina Fiala.Também sou do Laboratório Sham. Hoje mostraremos um procedimento para a análise de complexos MultiPro a partir de lisados celulares. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a composição de receptores de membrana com múltiplas subunidades.No entanto, neste vídeo, utilizamos o proteassoma tic como exemplo. Então, vamos começar. Antes do início deste procedimento, prepare todos os tampões conforme descrito no protocolo escrito e mantenha-os a quatro graus Celsius.Colete 10 milhões de células HEC 2 9 3 e forme um pellet por centrifugação a 350 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave os pellets celulares com um mililitro de PBS gelado e use centrifugação para obter o pellet das células lavadas. Repita essa lavagem duas vezes e, então, ressuspenda o pellet celular lavado em 250 microlitros de gelo.Adicione o tampão de lise nativa frio e azul à suspensão e incube-a em gelo por 15 minutos. Após a incubação, centrifugue as células vivas a 13.000 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius para remover o material insolúvel. Enquanto isso, derreta um orifício na tampa de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro utilizando o lado aquecido de diâmetro maior de uma pipeta de pasta.Em seguida, coloque o tubo no gelo para esfriar até quatro graus Celsius. Após a conclusão da centrifugação, transfira o lisado para o tubo destinado à remoção de sal por diálise. Coloque uma membrana de diálise com corte de 10 kilodaltons sobre o tubo aberto.Feche a tampa e corte qualquer excesso de membrana de diálise que estiver saliente. Em seguida, sela cuidadosamente o lado da tampa com parafina; uma vez selado, inverta o tubo e coloque-o de cabeça para baixo em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue a amostra à velocidade mais baixa possível durante 10 segundos.Em uma centrífuga de cultura celular, prepare um béquer de 100 mililitros com tampão de diálise azul nativo frio e um agitador magnético, utilizando pelo menos 10 mililitros de tampão de diálise azul nativo para cada 100 microlitros de amostra. Em seguida, remova o tubo invertido do tubo cônico usando pinças. Para evitar virar o tubo com a abertura para cima.Fixe o tubo com fita adesiva de cabeça para baixo dentro do béquer e remova todas as bolhas de ar do orifício sob a tampa. Usando uma pipeta Pasteur curvada, ligue o agitador magnético e deixe a amostra por seis horas ou durante a noite na câmara fria para realizar a diálise. Verifique a amostra ocasionalmente para garantir que a agitação não esteja formando bolhas de ar na membrana de diálise.Após a incubação, transfira o lisado celular dialisado para um novo tubo microcentrífuga previamente resfriado e mantenha-o em gelo até o carregamento no gradiente do gel. O preparo do gel é realizado à temperatura ambiente com um misturador de gradientes. Coloque o misturador de gradientes sobre uma placa de agitação e conecte-o a um pedaço de tubo flexível.Feche o canal do misturador de gradiente usando a válvula e feche o tubo com um grampo. Coloque um agitador magnético no cilindro conectado ao tubo. Em seguida, passe o tubo flexível por uma bomba peristáltica e fixe uma agulha de seringa na sua extremidade.Em seguida, coloque a agulha entre as duas placas de vidro na parte superior do aparelho de gel. Prepare soluções de gel separador a 4% e 15% de modo que os volumes combinados sejam iguais ao volume do gel separador. Adicione um PS e TM imediatamente antes.Use e despeje as soluções de gel nos cilindros correspondentes do misturador de gradiente. Em seguida, ligue o aparelho e abra a válvula. Pressione o cilindro esquerdo para expelir a bolha de ar presente no canal que conecta os dois reservatórios de gel.Ligue a bomba em cinco mililitros por minuto. Remova o clipe e permita que o gel escoe lentamente entre as placas de vidro. Levante lentamente a agulha à medida que o gel pausa, garantindo que a agulha esteja sempre acima do líquido.Deixe todo o líquido entrar no aparelho de gel. Em seguida, sobreponha cuidadosamente o líquido com isopropanol e lave o aparelho com água destilada. Deixe o gel polimerizar por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, prepare um gel de empilhamento a 3,2%, adicionando PS e TM me imediatamente antes do uso. Despeje o gel de empilhamento sobre o gel de separação e insira o pente entre as lâminas de vidro, evitando bolhas. Após a polimerização do gel de empilhamento, resfrie o gel imediatamente para quatro graus Celsius antes da aplicação da amostra.Remova o pente lentamente, puxando-o em um ângulo em relação ao plano do gel. Isso permite que o ar entre rapidamente nos bolsos, o que melhora a qualidade dos poços para separar o lisado celular dialisado por blue native page: carregue 20 microlitros do marcador de ferritina e 40 microlitros do lisado dialisado nos poços secos. A quatro graus Celsius, os poços vazios são preenchidos com volumes iguais de tampão de diálise. Em seguida, recubra as amostras em cada poço com tampão catódico frio.Preencha a câmara interna com tampão catódico frio e a câmara externa com tampão anódico frio. Trabalhe a quatro graus Celsius e aplique 100 volts até que as amostras tenham entrado no gel de separação. Em seguida, aumente a voltagem para 180 volts e execute o gel até que a frente do corante atinja o final do gel.O processo leva de três a quatro horas. Para a eletroforese SDS-PAGE em segunda dimensão, prepare um gel padrão de 10% SDS com uma única faixa larga. Uma faixa para o marcador de peso molecular e outra para uma alíquota do controle de lisado dialisado que foi misturada com tampão amostral de SDS e fervida por cinco minutos a 95 graus Celsius. Remova o gel de eletroforese azul nativo com as placas do aparelho de eletroforese e levante suavemente uma das placas.Remova o gel de empilhamento e recorte a faixa do gel Blue Native PAGE contendo as proteínas de interesse. Coloque o fragmento do gel Blue Native PAGE no tampão amostral de SDS e incube por 10 minutos à temperatura ambiente em agitador. Após a incubação, ferva brevemente o fragmento do gel em um micro-ondas e, em seguida, incube por mais 15 minutos.No tamp&atilde;o amostra SDS em um agitador, remova o pente do gel SDS e preencha algumas c&eacute;lulas com tamp&atilde;o SDS; carregue a fatia do gel blue native page na c&eacute;lula grande do gel SDS. Evite bolhas de ar. Voc&ecirc; pode querer usar uma pin&ccedil;a para ajudar, j&aacute; que a fatia de gel deve estar exatamente sobre o gel de empilhamento.Cubra o corte com tampão amostral de SDS, em seguida carregue o marcador e o controle de lisado. Realize a eletroforese e a transferência de proteínas conforme protocolos padrão. Para interpretar os resultados, é importante saber que a posição de uma proteína na segunda dimensão da eletroforese azul nativa em gel de SDS fornece evidências sobre se a proteína faz parte de um complexo MultiPro ou não.Proteínas monoméricas migrarão em uma diagonal hiperbólica devido ao gradiente do gel na primeira dimensão e como um gel linear na segunda dimensão; os subunidades de complexos MultiPro serão encontradas abaixo da diagonal, formando uma linha vertical. Se uma determinada proteína faz parte de complexos distintos, várias manchas são detectadas em uma linha horizontal. Em resumo, a abordagem bidimensional de eletroforese nativa azul e SDS-PAGE permite a determinação da composição, tamanho e abundância relativa dos complexos MultiPro.Nesta demonstração, diversos proteassomos ou subunidades foram detectados por meio de western blotting. As subunidades beta dois e MCP 21 puderam ser detectadas como pontos individuais dispostos verticalmente, indicando que fazem parte dos mesmos complexos. PA 28 é encontrado em uma mesma linha vertical com beta dois e CP 21, sendo, portanto, parte do mesmo complexo.Ao observar as linhas horizontais, pode-se notar que beta dois e MCP 21 fazem parte de três complexos distintos. PA 28 é encontrado apenas em um desses complexos. Portanto, esses complexos MultiPro poderiam ser identificados como o proteassoma 20 S e o proteassoma 20 S.Juntamente com a P 28 e o proteassoma 20 S isolado, acabamos de mostrar como separar e caracterizar complexos MultiPro nativos de um lisado celular utilizando eletroforese nativa azul. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de dialisar cuidadosamente a amostra. Para evitar o contato com SDS e manter sempre o trabalho a quatro graus, recomendamos comparar diferentes detergentes para a lise celular, a fim de garantir tanto a integridade dos complexos motores quanto a melhor solubilização.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Estou fora.

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