Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Ratos transgênicos para receptores de células T específicos para antígenos foram indispensáveis no estudo do desenvolvimento e da função das células T para gerar modelos de camundongos com especificidades de receptor de células T predefinidas usando transferência nuclear de células somáticas ou SCNT. Um camundongo é infectado com um patógeno de interesse. Células T são isoladas do camundongo e então purificadas por meio de triagem celular ativada por fluorescência.

Os linfócitos T purificados são então utilizados para transferência nuclear de células somáticas. Após os embriões atingirem o estágio de blastocisto, células-tronco embrionárias são isoladas. Essas células são então injetadas em blastocistos, os quais são posteriormente transferidos para camundongos pseudo-grávidos.

As crias resultantes expressam um aumento acentuado na população de células T de interesse, o que pode ser validado pela análise de PAX. Olá, meu nome é Okta AK e sou pós-doutorando aqui no Instituto White de Pesquisa Biomédica. Hoje vou mostrar a você como realizar injeções somáticas de transferência de blastocisto com auxílio de CLE, bem como a transferência de embriões.

A principal vantagem da transferência somática é que é possível gerar modelos de camundongos que expressam seu receptor de célula T a partir do locus endógeno, e, portanto, sob controle do promotor endógeno, além de permitir a geração rápida de modelos de camundongos. A transferência somática em estado líquido pode ser utilizada como uma ferramenta para gerar modelos de camundongos com especificidades predeterminadas de receptor de célula T ou receptor de célula B. Isso é de especial interesse para pesquisadores que atuam em áreas como autoimunidade, doenças infecciosas e câncer.

Para isolar linfócitos T específicos para um patógeno como Toxoplasma gondii, camundongos infectados são sacrificados por injeção intraperitoneal no auge da resposta imune, o baço é isolado do camundongo eutanasiado e as células doadoras são então homogeneizadas, isoladas e incubadas com anticorpos marcados fluorescentemente e o tetramero apropriado. Finalmente, a triagem por citometria de fluxo é realizada para obter linfócitos T específicos para o patógeno. Na noite anterior ao procedimento de enucleação de ovócitos.

Prepare agulhas de injeção de piso com quatro, cinco e sete micrômetros usando uma seringa para carregá-las retrogradamente com mercúrio. No dia seguinte, inicie o protocolo de transferência nuclear de células somáticas coletando ovócitos e, em seguida, usando uma pipeta bucal, transfira-os para gotas de meio K-S-O-M-A-A em uma placa de Petri. Na tampa da placa de Petri.

Prepare aate para realizar a transferência nuclear de células somáticas ou SCNT colocando cerca de 10 gotas de PVP. Cerca de 10 gotas de HCZB contendo cinco microgramas por mililitro de cyto B e cerca de 10 gotas de HCCB contendo 2,5 microgramas por mililitro de cyto B. Esta placa será denominada placa S-C-N-T-A. Coloque a placa S-C-N-T-A sobre a platina de um microscópio composto invertido.

Em seguida, coloque uma agulha de enucleação de sete micrômetros no micromanipulador e lave-a aspirando e descartando a solução de PVP de cinco a 10 vezes. Em seguida, transfira de 10 a 30 cítos arrestados em metáfase II da placa de Petri para uma das gotas de HCCB com cinco microgramas por mililitro. Incube os cítos B na placa S-C-N-T-A por cinco minutos à temperatura ambiente; durante a incubação, alinhe os ovócitos horizontalmente.

Após cinco minutos terem se passado, use a agulha de enucleação para posicionar um ovócito diante da agulha de fixação. Utilizando um microinjetor, aplique vácuo para fixar o ovócito à agulha de micropipeta de retenção.

Em seguida, utilizando a agulha de enucleação, gire o ovócito até que o complexo do fuso cromossômico, que aparece hipertransparente em comparação com o citoplasma opaco, esteja na posição das três horas; inicie um pulso de pizo pressionando o pedal para penetrar a zona pelúcida. Um pulso de pizo é um pulso mecânico que se propaga longitudinalmente e faz vibrar a ponta da agulha de enucleação. As vibrações da ponta auxiliam na perfuração da zona pelúcida.

Após atravessar a zona pelúcida, posicione a abertura da agulha de nucleação adjacente ao fuso da metáfase II e aplique o vácuo. O complexo do fuso cromossômico entrará lentamente na agulha. Após a remoção da agulha, a membrana deve selar-se por si mesma.

Por fim, utilizando uma pipeta bucal, transfira os citos enucleados de volta para as gotas de K-S-O-M-A-A. Em seguida, usando a mesma pipeta, lave-os transferindo-os de gota a gota de KSOM AA. Para realizar a transferência nuclear, substitua a agulha de enucleação de sete micrômetros no micromanipulador por uma agulha de transferência nuclear de quatro a cinco micrômetros. Lave a agulha com PVP como anteriormente.

Coloque os linfócitos T CD8 positivos isolados anteriormente em uma gota de PVP na placa S-C-N-D-A. Misture bem e incube por pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira de 10 a 30 citoes anucleados para uma gota de HCZB com 2,5 microgramas por mililitro.

Cultive o citoplasma B na placa S ct. A por cinco minutos à temperatura ambiente. Durante a incubação, use a agulha de transferência nuclear para alinhar os citoplasmas horizontalmente utilizando a agulha de injeção.

Pegue uma célula doadora CD8 positiva do meio PVP e aspire para dentro e para fora até que a membrana externa se rompa. Se necessário, aplique um pulso de pizo; fragmentos da membrana e do citosol devem ser visíveis. Aspire o núcleo para dentro da agulha.

Em seguida, continue a coletar núcleos até haver entre 10 e 30. Depois, desloque-se até a gota contendo os citos anucleados alinhados. Aplique o vácuo para fixar um ovócito à agulha de contenção.

Em seguida, posicione a agulha de transferência nuclear NU ao lado da zop lucita com os núcleos orientados para longe da abertura. Aplique um pulso de pizo até que a agulha atravesse a zop lucita. Empurre o micromanipulador para mover cuidadosamente um núcleo até a ponta da agulha.

Introduza a agulha no ovócito até que a ponta da agulha esteja a dois terços do caminho no interior. Aplique uma pequena pressão negativa para que um pouco da membrana do ovócito entre na agulha. O próximo passo é muito crítico.

Como é o único momento em que o oócito está realmente aberto, aplique um único pulso ZO. Em seguida, aplique pressão positiva para empurrar o núcleo para fora da agulha.

Puxe cuidadosamente a agulha para trás, de modo que a ponta fique aproximadamente um terço dentro do ovócito, e então aplique pressão negativa e continue puxando a agulha para trás. Para selar o ovócito. Repita este passo com cada ovócito.

Após todos os ovócitos terem recebido um núcleo, transfira-os para a placa de Petri e lave-os transferindo-os de gota a gota de meio KS OM AA, incubando a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, transfira os embriões SCN T para gotas de meio de ativação sem cálcio contendo cloreto de estrôncio. O cloreto de estrôncio ativa o ovócito induzindo oscilações de cálcio semelhantes às que ocorreriam durante a fertilização.

Incube por seis horas. Se desejado, adicione TSA, que é um inibidor inespecífico das histonas diacetilases, ao meio de ativação. Para melhorar a eficiência após a ativação, examine os embriões ao microscópio invertido para determinar a quantidade de pseudo-pronúcleos ou embriões SCNT positivos para PPN. Os PPN podem ser identificados com base em sua aparência.

Elas parecem ovos. Lave e cultive com a parte da gema para cima. Os embriões e as gotas K-S-O-M-A-A são mantidos por três dias e meio a 37 graus Celsius até atingirem o estágio de blastocisto.

No início, você deve se concentrar em realizar corretamente os procedimentos que acabamos de mostrar para nucleação e transferência nuclear NU. Uma vez que você tenha dominado essas técnicas, os procedimentos seguintes serão mais fáceis de executar. As células-tronco embrionárias ou células ES utilizadas aqui foram obtidas usando técnicas padrão.

Estes devem ser preparados no dia da injeção assistida por explosão, três dias e meio após o coito. Prepare a tampa de uma placa bacteriana estéril colocando gotas contendo PVP e HCZP. Em seguida, prepare uma agulha de injeção de 15 micrômetros para o pulso piso como anteriormente.

Em seguida, coloque a agulha de injeção no micromanipulador e lave-a com transferência de PVP. Realize de 10 a 30 auxílios de blast em uma gota de HCZB. Em seguida, coloque de cinco a 50 microlitros da suspensão de ESL em outra gota de HCZB.

Deve haver células ES suficientes para que possam ser facilmente aspiradas, mas sem estarem muito próximas umas das outras. Em seguida, aspire 30 a 100 células ES com a agulha de injeção. Transfira para a gota com o blastocisto auxiliar.

Alinhe o assistente de blastocisto horizontalmente e fixe um com a agulha de contenção aplicando vácuo. Use a agulha de injeção para girar o assistente de blastocisto até que a massa celular interna esteja às nove horas. Posicione a agulha de injeção às três horas.

Certifique-se de que não há células-tronco embrionárias na ponta da agulha e aplique um pulso piso até que a agulha de injeção atravesse a zop lucita e a trifecta, atingindo o selo blastular. Libere de cinco a 15 células-tronco embrionárias para que aderem à massa celular interna. Continue até que todos os blastocistos tenham sido injetados após a conclusão das injeções.

Lave duas vezes em K-S-O-M-A-A e prossiga para a transferência cirúrgica de embriões para fêmeas pseudogestantes. Posicione e anestesie uma fêmea receptora pseudogestante na área cirúrgica. Usando uma máquina elétrica de barbear, remova os pelos do quadrante inferior direito. Desinfete a área utilizando uma solução à base de iodo e etanol 70% sob microscópio estereoscópico.

Use uma tesoura para abrir a pele, em seguida, coloque a tesoura fechada entre a pele e o peritônio e abra-a para separar o peritônio da pele. Localize o ovário através do peritônio, que deve aparecer como uma mancha vermelha. Em seguida, use a tesoura para abrir o peritônio nessa região.

Use uma pinça para segurar cuidadosamente o TCU ou a gordura ao redor e puxar o útero utilizando uma capilar conectada a uma pipeta de boca. Pegue um grupo de cerca de 10 blastocistos segurando o oviduto e o útero com pinças. Use uma agulha para fazer um pequeno furo no útero.

Em seguida, insira a capilar com assistência de jato no lúmen do útero e libere-os. Recoloque o útero de volta na cavidade abdominal. Localize as bordas do peritônio e feche-as com alguns pontos.

Feche a pele do camundongo com alguns grampos. Administre medicamento analgésico por via subcutânea. Em seguida, transfira o camundongo de volta para sua gaiola sob uma lâmpada de aquecimento.

Monitore a respiração do camundongo até que ele acorde. Após enucleação e transferência nuclear de células somáticas. Cerca de 70% dos embriões foram positivos para pseudoprónúcleos.

Conforme mostrado nesta figura. O tratamento com TSA por seis ou dez horas não teve efeito. Após três dias e meio em cultura, de 5 a 10% dos embriões desenvolveram-se até a fase de blastocisto.

Novamente, a adição de TSA não teve efeito sobre a taxa de desenvolvimento do blastocisto auxiliado. Os blastocistos auxiliados por TCNU foram então utilizados para derivar células-tronco embrionárias. O TSA melhorou significativamente a taxa na qual as LCE foram derivadas do blastocisto auxiliado.

As células S-C-N-T-E-S são utilizadas para gerar camundongos quiméricos. O sangue é coletado desses camundongos e analisado quanto à presença de linfócitos T específicos utilizando a análise de facts conforme mostrado aqui. Quando o sangue é corado com anticorpo anti-CDA e tetramero específico, uma população duplamente positiva pode ser identificada.

Indicando que a célula doadora utilizada para a TCNS era de especificidade correta. Acabei de mostrar como realizar a transferência de células somáticas LU, injeções com auxílio de blastocisto e transferência de embriões. O ponto mais importante a ser considerado é a pureza de suas células T ou células B.

Uma vez que você tenha aprendido a realizar a transferência somática e seus embriões estejam em estágio de blastocisto, você pode optar por transferi-los diretamente para fêmeas pseudo-grávidas ou utilizá-los para derivar células-tronco embrionárias e gerar camundongos quiméricos.