Name: Imagem vertical de Drosophila Os embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda um protocolo de montagem para embriões de Drosophila em posição vertical usando gelatina de glicerina e microscopia confocal. Este método permite medições precisas de tamanho e quantificação de expressão gênica.

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Os autores são especialmente gratos a Deborah Harris e MacKay Danielle. Suporte para este trabalho foi fornecida pelo Departamento de Biologia e da Faculdade de Artes e Ciências de CWRU, e por HHMI número de concessão 52005866 para apoio ao ensino de graduação em ciências biológicas.

1. Metodologia de imagens <ol><li> Derreter a glicerina em uma geléia de 55 ° C banho de água grau por 20-30 minutos até que se torne um líquido homogêneo. Redemoinho, mas não agitar o frasco para evitar a formação de bolhas. </li><li> Enquanto a gelatina derrete, aplique uma camada fina de glicerol usando um Kimwipe em uma lâmina de vidro limpa (opcional). </li><li> Pipeta mL 1-1,5 de glicerina derretida geléia usando um corte de ponta da pipeta P1000 na superfície da lâmina para criar uma camada fina em primeiro lugar. Pipeta com cuidado para evitar bolhas. </li><li> Deixe a gelatina solidificar por 5 min em uma superfície horizontal, em seguida, coloque o slide a -20 ° C por 5 min e proceder ao alinhamento do embrião. Alternativamente, cobrir a lâmina com Saran Wrap e coloque-a 4 ° C por até 5 dias. </li><li> Pipetar uma pequena gota de embriões manchada em glicerol 70% / PBS ou outros Antifade glicerol baseada meios de montagem (por exemplo, ou Slowfade Vectashield) no lado da cama de geléia. </li><li> Começar a pré-alinhamento dos embriões por transferi-los individualmente a partir da queda para a superfície da geléia. Transferi-los usando uma agulha hipodérmica inclinada, usando o lado inclinado como uma colher. </li><li> Cerca de colocar os embriões ao longo de 2-3 colunas. Se um embrião fica preso na agulha, mexa na gota contendo os embriões outros para liberá-lo. Não perca tempo alinhando-as com cuidado neste momento. Deixe algum espaço entre as colunas. </li><li> Alinhar os embriões deslizando-los horizontalmente no meio de geléia com o auxílio da agulha hipodérmica. Enquanto desliza, orientar o cara e coroa na mesma direção. Torná-los paralelos um ao outro ao longo da coluna. Remover o excesso de glicerol PBS esquerda como uma trilha com um pedaço de Kimiwipe torcida. Nota: glicerol em excesso causará embriões para ser vagamente envolto em gel, resultando na separação das duas camadas de geléia, tornando-o difícil de cortar e montar. Por outro lado, a remoção de glicerol demais vai secar e alisar os embriões. </li><li> Use uma ponta de corte amarelo para espalhar uma fina camada de geléia sobre os embriões (50-150 mL, dependendo de quantas foram alinhados). </li><li> Slides lugar no freezer -20 ° C por 10-20 min ou guarde-a 4 ° C durante a noite. Certifique-se que a geléia é completamente rígida, antes de cortar. Caso contrário, o bloco de embriões será muito difícil especiais de consumo. Os melhores resultados são obtidos para o corte no dia seguinte. </li><li> De acordo com um escopo de dissecação, use uma lâmina de barbear para cortar completamente através da geléia de ambos os lados dos embriões alinhados. Segure a lâmina de barbear em um ângulo de 90 ° para fazer cortes retos. Os cortes devem ser feitos muito perto dos pólos anterior e posterior dos embriões para evitar o excesso de geléia que pode obstruir imagem. </li><li> Adicionar 100-200 mL de frio PBT (4 ° C, PBS 0,1% Tween 20) próximo aos cortes e com cuidado raspe a gelatina entre os embriões usando uma espátula. Nota: O detergente em PBT ajuda a remoção da geléia a partir do slide sem danificar embriões. </li><li> Usando uma agulha, transferir o bloco de geléia com embriões incorporados a um slide limpa para cortar ainda mais. Cortar blocos menores com embriões 5-7. Use PBT facilmente mover o bloco de gelatina. Alternativamente, coloque o bloco sobre uma superfície de vidro seco para deixá-lo ligar para o vidro, o que gera mais estabilidade para cortar precisamente a geléia, se necessário. </li><li> Virar na vertical os embriões embutido na geléia com o auxílio de uma lâmina de barbear e uma agulha. Para visualização no microscópio, prosseguir com qualquer uma das duas etapas abaixo, dependendo do tipo de microscópio estar sendo usado. </li><li> Microscópio invertido: lugar terminou blocos de embrião para uma lamela de comprimento, com embriões em posição vertical. Verifique se o lado do embrião com a menor quantidade de geléia estará em contato mais próximo com o objectivo. </li><li> Microscópio vertical: fazer duas pilhas com quatro # 1 lamínulas coladas com super cola para ser usado como "suporte" e colocar o bloco de embriões em glicerol entre as "suporta". Ponte das pilhas usando uma lamela de comprimento. </li><li> Confocal para análise, verificar a distância de trabalho dos objectivos a ser usado para descobrir se você pode imaginar todo o caminho através do embrião ou apenas parcialmente. Por exemplo, D. embriões têm melanogaster ~ 0,55 milímetros de comprimento e pode ser inteiramente fotografada usando uma lente 20x Plano de Apo-ou 40x LD objetivo Neo-Fluor. O site a seguir tem informações sobre os objectivos Zeiss disponíveis e lhe dá a opção de pesquisar os objectivos de acordo com distâncias de trabalho: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Resultados representante Porque os embriões são deixados intactos, este método pode ser usado para fazer medições precisas de tamanho do embrião e as distâncias entre os padrões de expressão gênica. Na Figura 1, mostramos uma embriões blastoderma estágio manchadas com o DAPI nuclear mancha (azul), anti-dorsais proteína (vermelho), mRNA sog (amarelo) e mRNA sna (verde). Proces morfológicasses, como a invaginação do mesoderma (Figura 2A, B) e migração das células mesodérmica (Figura 3 e 4) também pode ser visualizado utilizando este método. Diferentes posições-Z ao longo do eixo DV podem ser obtidas alterando o plano focal, como mostrado nas Figuras 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vertical óptico fatia de um embrião intacto em estágio blastoderma. Coloração duplo mRNA e proteína. MRNAs alvo para sondas em situ (sog e sna) e proteína manchada pelo anticorpo primário (anti-Dorsal) são indicadas na figura. DAPI foi usado para rotular os núcleos. Note-se que a expressão de sog e sna estão localizados no citoplasma apical, enquanto a expressão de dorsais é nuclear. Sinais fortes de transcrições sog nascentes que estão localizadas em núcleos também podem ser vistos sob esta ampliação. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Testes de imagem na vertical de um embrião intacto gastrulating. MRNA utilizados e suas respectivas cores são indicadas na figura. A) Note-se que nesta fase, três genes corados com fluor mesmo (sna, sog e dpp, em verde), são expressos em domínios separados espacialmente. A mesoderme invaginante expressa sna, a camada de neuroblastos expressa ind eo ectoderma expressa dpp, enquanto expressão sog ainda está presente nas regiões ventral do sistema nervoso. B) Em um plano mais profundo confocal do embrião mesmo, notamos a base do mesoderma invaginante fortemente expressa sna, mas a sua região apical expressa níveis mais baixos. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagem na vertical de um embrião intacto com a banda de germe estendida sog RNA (amarelo);. Caracol, ind e mRNAs dpp (verde), proteína dorsais (vermelho). Núcleos foram corados com DAPI (azul). A) plano focal perto da cabeça do embrião. B) Outro plano focal na região do tronco de embrião. Nota massa de células antes da migração mesodérmica lateral (compare a Figura 4) deitado próximo à linha média ventral em ambos os lados de um embrião de germe de banda estendida. Neuroblastos delaminação são rotulados em verde (ind e sna). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Imagem na vertical de um embrião intacto durante a extensão banda germe sog RNA (amarelo);. Caracol, ind e mRNAs dpp (verde), proteína dorsais (vermelho). A) Observe o neuroblastos delaminação do epitélio (seta), manchado tanto para ind e sna nesta fase (verde). Note-se também a expressão restrito de sog à linha média ventral (amarelo). Expressão de dpp nesta fase pode ser visto em laterais do embrião (asterisco). B) seção Optical no embrião mesmo mostrado na A perto do final do comprimento do embrião, o que corresponde a mid-posterior região. As células da linha média ventral estão manchadas de sog.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Obtenção de imagens seção transversal de embriões Drosophila pode ser um desafio, pois exige tanto uma dissecção cuidadosa das mãos de fatias 2 ou o uso de meios embutido para micrótomo de processamento, que normalmente é prejudicial para colorações fluorescentes. Alternativamente, Z-stacks feita em um microscópio confocal pode ser usado para fazer a reconstrução 3D de seção transversal imagens. No entanto, é demorado para fazer várias fatias finas de Confocal para uma reconstrução 3D preciso e torna-se problemático fotobranqueamento. Outra preocupação quando embriões de imagem que são montados longitudinalmente é o espalhamento de luz que ocorre quando chegar seções mais profundas do embrião, o que também complica a tomar medidas precisas de sinais fluorescentes para fins de quantificação dos níveis de proteína ou mRNA expressão 1. Mesmo com um microscópio de dois fotões confocal, espalhamento de luz ainda é uma preocupação devido à opacidade do material gema no meio do embrião, o que faz seleção de meios de montagem de transparência ideal da amostra a ser limitado. Para contornar esses problemas, uma nova técnica chamada &quot;End-on&quot; de imagens de embriões de posicionamento vertical foi recentemente desenvolvido para a imagem ao vivo e amostras fixas 4. Neste trabalho, desenvolvemos um novo protocolo para embriões montado verticalmente, que permite uma preparação simples e visualização de embriões fixo ou tecidos de qualquer tamanho e forma que são corados com múltiplas sondas situ 3. Nosso método consiste em utilizar uma mídia de montagem com consistência gelatinosa que é usado para envolver embriões alinhados dentro dele. Blocos cortados deste meios de montagem contendo embriões incorporado pode ser posicionada na vertical antes de imagens em qualquer tipo de microscópio confocal. Ao incorporar os embriões para a geléia e posicioná-los na vertical, somos capazes de tomar horizontal cross-seções usando microscopia confocal, em que as células ao longo do eixo dorsal-ventral do embrião são apresentados simultaneamente. Esta é uma melhoria significativa para fins de quantificação desde problemas de espalhamento de luz e fotodegradação de corantes fluorescentes que ocorre na reconstrução Z-stack convencional de embriões montado longitudinalmente agora são eliminados. Assim, a quantificação dos níveis de expressão de gene ou proteína ao longo do eixo dorsal-ventral é precisa, uma vez que as células localizadas na frente dorsal-ventral posições são gravadas ao mesmo tempo e, ao mesmo confocal Z-position. Além disso, o método descrito nos permite obter uma imagem 2-D completo ao longo do eixo dorsal-ventral de um embrião de 3-D sem o uso de complexos métodos computacionais unrolling para visualizar as células em diferentes posições ao longo do eixo DV 6. Alguns dos passos críticos incluem a remoção de glicerol em excesso após o alinhamento embriões, para evitar a divisão entre as duas camadas de geléia. No entanto, se a amostra é muito desidratado, a imagem resultante será disforme e têm morfologia incorreta. Além disso, se o meio de geléia de todo o embrião é cortado em um ângulo em vez de reto, a imagem resultante pode parecer menos redondo e mais ovular em forma, devido a um posicionamento incorreto dos embriões em um ângulo diferente de 90 graus. Finalmente, se a geléia não é cortado perto o suficiente para o embrião nas extremidades anterior / posterior, não é possível obter uma imagem apropriada porque a distância de trabalho o objetivo seria usado principalmente para se focalizar no jelly e não o embrião. Outro passo importante que pode ser necessária quando embrião imagem final gastrulating é cuidadosamente classificar os estágios de interesse no âmbito antes de alinhar-los. Normalmente, os embriões são encenadas de acordo com características morfológicas que podem ser mais facilmente reconhecida quando em uma posição longitudinal. Entre as modificações alternativa que pode ser feito com este método é incluir um reagente anti-fade (por exemplo, p-fenilenodiamina ou PPD) para a segunda camada de gelatina para ajudar a proteger contra a fotodegradação de corantes fluorescentes.

<table><tbody><tr><td>Mídia de montagem em gelatina glicerada</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Contém baixa concentração de fenol como conservante e deve ser usada em capela ou em área bem ventilada. A receita para preparar sua própria mídia é descrita em Zander, 1997.</td></tr><tr><td>Confocal Zeiss LSM 700</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Os seguintes objetivos foram utilizados: Plan-Apo 20x 0,8 M27 (WD 0,55 mm); EC Plan-Neofluar 40x 1,3 óleo (WD 0,21 mm); LD Plan-Neofluar 0,6 Korr 40X (WD 2,9 mm).</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscopia de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura de vidro</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>Tamanho 1 &amp;#189; (específico para os objetivos utilizados neste trabalho).</td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura de vidro (para fabricação de suportes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Utilize quatro lâminas de cobertura coladas com cola instantânea.</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td></td><td></td><td>Lâminas industriais de aço com borda única</td></tr><tr><td>Esptula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas hipodérmicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>26 Gauge</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem vertical de drosophila os embriões

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Vários gradientes conhecidos morfogenéticos e movimentos celulares ocorrem ao longo do eixo dorsal / ventral da<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrião. No entanto, as técnicas atuais usado para visualizar esses processos são um pouco limitadas. O protocolo a seguir descreve uma nova técnica para montagem fixa e rotulados<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões para visualização coronal com imagem confocal. Este método consiste em incorporar embriões entre duas camadas de mídia glicerina geléia de montagem, e as tiras de geléia de imagens posicionadas na vertical. O primeiro passo para imprensando os embriões é fazer uma cama fina de geléia de glicerina em um slide. Em seguida, os embriões são cuidadosamente alinhados nesta superfície e coberto com uma segunda camada de geléia. Após a segunda camada é solidificado, tiras de gelatina são cortadas e capotou na vertical para geração de imagens. Alternativas são descritas para visualizar os embriões, dependendo do tipo de stand microscópio para ser usado. Uma vez que todas as células ao longo do eixo dorsal-ventral são gravadas dentro de um único confocal Z-plano, o nosso método permite a medição precisa e comparação dos sinais fluorescentes sem fotobranqueamento ou espalhamento de luz comum para reconstruções em 3D de embriões montado longitudinalmente.

Aqui apresentamos um protocolo de montagem para manchada<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões em posição vertical que permite que imagens de secções transversais através de microscopia confocal.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Diversos gradientes morfogenéticos e movimentos celulares bem conhecidos ocorrem ao longo do eixo dorsal/ventral do embrião de Drosophila. No entanto, o atual...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens em corte coronal de embriões de oph intactos utilizando microscopia confocal, que possam ser usadas para medir com precisão o tamanho do embrião e quantificar os níveis de expressão de proteínas e RNA. Isso é alcançado utilizando um meio de montagem de consistência gelatinosa para envolver os embriões e posicioná-los na posição vertical. Como primeiro passo.Os embriões são alinhados sobre uma fina camada de gelatina de glicerina e, em seguida, cobertos com uma segunda camada deste meio. Em seguida, o meio de montagem contendo os embriões é cortado em blocos, que podem ser virados verticalmente para segurar. Os embriões em posição para obtenção de imagens resultam em imagens de seção transversal visualizadas com qualquer tipo de microscópio confocal.Olá, meu nome é Milu. Sou estudante de pós-graduação no Meso Lab do departamento de biologia da Case Western Reserve University. Hoje vamos demonstrar um protocolo de montagem para imagens de embriões PHI em posição dorsal utilizando um microscópio confocal.Desenvolvemos este método durante o laboratório do nosso curso de biologia do desenvolvimento na Case, em colaboração com o Dr. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a técnica de imagem Endon desenvolvida pelo Laboratório Mindin, é que ela permite a preparação simples e a visualização de embriões ou tecidos fixados de qualquer tamanho e forma. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando precisamos visualizar seções transversais de embriões muito pequenos de outras espécies de gesso, que seriam muito difíceis de cortar manualmente. Este método pode ajudar a responder perguntas no campo da biologia do desenvolvimento, permitindo quantificações precisas da expressão gênica e dos níveis de proteína ao longo do eixo dorsal-ventral.Normalmente, os embriões são montados longitudinalmente. Embora seja possível obter reconstruções de Zacks de seções transversais, frequentemente ocorre o problema de fotobranqueamento dos olhos fluorescentes e dispersão da luz, além de ser muito demorado. Nossa técnica minimiza esses problemas porque as imagens de seções transversais dos embriões são visualizadas ao longo de um único ponto confocal.Em geral, indivíduos novos neste método podem enfrentar algumas dificuldades ao cortar os blocos de gelatina glicerinada próximos à extremidade dos embriões. A demonstração visual deste método é essencial, pois exige manipulação cuidadosa. Temos hoje uma demonstração realizada por nossos alunos, Catherine Chen e Catty, para preparar embriões de drosófila para imagem em microscopia vertical.Primeiro, derreta a gelatina de glicerina em banho-maria a 55 graus Celsius por 20 a 30 minutos até que se torne um líquido homogêneo e turvo. Porém, não agite o frasco para evitar a formação de bolhas. Usando uma ponteira de pipeta P 1000 cortada, pipete cuidadosamente um mililitro de gelatina de glicerina derretida sobre a lâmina.Para criar uma camada fina e uniforme, livre de bolhas de ar, deixe a geleia solidificar por cinco minutos sobre uma superfície horizontal. Em seguida, coloque a lâmina em um congelador a menos 20 graus Celsius por cinco minutos. Alternativamente, cubra a lâmina com filme plástico e mantenha-a a quatro graus Celsius por até cinco dias.Uma vez que a primeira camada de gelatina esteja solidificada, leve a lâmina ao microscópio e prossiga com o alinhamento dos embriões. Pipete uma pequena quantidade de embriões corados e glicerol em PBS 70% na lateral da primeira camada de gelatina. Sob o microscópio, alinhe os embriões lado a lado ao longo de três a quatro colunas por lâmina.Use uma agulha hipodérmica para pegá-los utilizando o lado inclinado da agulha, como se fosse uma colher. Oriente cuidadosamente as cabeças de todos os embriões na mesma direção, deslizando-os horizontalmente sobre o meio em gelatina com a ajuda da agulha.A configuração final dos embriões alinhados será semelhante à descrita para injeção de DNA. Usando um pedaço torcido de lenço de papel Kim, remova o excesso de PBS com glicerol dos embriões. Pipete cuidadosamente entre 50 e 300 microlitros de gelatina de glicerina derretida sobre os embriões, dependendo do número de embriões, para formar uma segunda camada de gelatina.Por fim, resfrie a lâmina a menos 20 graus Celsius por cinco a 10 minutos, ou armazene-a a quatro graus Celsius durante a noite. Para remover os embriões embutidos em glicerol da lâmina para imagem em um microscópio estereoscópico, use uma lâmina de barbear para cortar através do gel próximo às extremidades anterior e posterior dos embriões alinhados. Mantenha a lâmina de barbear em um ângulo de 90 graus.Para fazer cortes retos, adicione de 100 a 200 microlitros de PBT frio ao lado dos cortes. Para remover cuidadosamente o gel ao lado dos embriões. Usando uma espátula, o PBT ajuda a soltar o bloco de embriões.Transfira o bloco para uma lâmina de microscópio seca para cortes adicionais. Primeiro, corte blocos menores contendo cinco a sete embriões cada. Em seguida, retire o excesso de gelatina glicerada que possa interferir na obtenção de imagens.Por fim, vire os embriões embutidos para uma posição ereta com a ajuda de uma lâmina de barbear e uma agulha. Para visualizar embriões de drosophila utilizando um microscópio confocal invertido, coloque o bloco de gelatina contendo os embriões sobre uma lamínula. Certifique-se de que a região do embrião com a menor quantidade de gelatina esteja em contato mais próximo com a objetiva.Se estiver usando um microscópio ereto para obter imagens, faça quatro pilhas de cola supra. Primeiro, cubra as lamínulas que serão usadas como suportes e coloque o bloco embrionário em glicerol entre os suportes. Una as pilhas usando uma lamínula maior para análise confocal.Coloque o espécime na platina do microscópio. Verifique a distância de trabalho das objetivas que serão utilizadas para determinar se é possível obter imagens através de todo o embrião ou apenas parcialmente; configure a configuração confocal no computador para iniciar a aquisição de imagens conforme mostrado aqui. Se o protocolo for realizado corretamente, poderão ser observadas imagens de seções transversais de embriões com morfologia intacta, pois os embriões são mantidos intactos.Este método pode ser utilizado para obter medidas precisas dos tamanhos dos embriões e dos níveis de expressão gênica ao longo do eixo dorsal-ventral. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 a 45 minutos. É importante remover o excesso de glicerol antes de despejar a segunda camada de gelatina de glicerina sobre os embriões.Caso contrário, as duas camadas podem se separar e tornar a etapa de corte mais difícil. Além disso, é necessário verificar a distância de trabalho das objetivas que você está utilizando para garantir que seja possível imaginar todo o embrião ou apenas uma parte dele, pois a distância de trabalho limita a extensão que pode ser observada. Certifique-se de cortar o gel próximo ao lado do embrião que será posicionado em direção à objetiva.Caso contrário, você estará obtendo imagens apenas da geleia em vez dos embriões. Após assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como obter imagens em corte transversal de embriões Joseph. Obrigado por nos assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

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Biologia

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