Name: Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Aprenda mutagênese dirigida e patch clamp em células de mamíferos para analisar mutações em canais de potássio GRK. Este método permite estudar ativação por álcool e receptores acoplados a proteína G.

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O nosso trabalho foi possível graças ao apoio financeiro do Fundo de Dotação McKnight for Neuroscience (PAS), do Instituto Nacional do Abuso de Drogas (R01 DA019022; PAS) e uma pré-doutoramento NIH NRSA bolsa para PA (F31AA017042) do Instituto Nacional de Abuso do Álcool e Alcoolismo. O mutante GIRK2-L257W foi fornecido pelo Dr. Prafulla Aryal. Microscópio de fluorescência e patrocínio gentilmente cedido pela Leica Instruments.

1. Site Dirigido Mutagênese Usamos a expressão de mamíferos pcDNA3.1 plasmídeo um cDNA para GIRK2 e introduzir uma mutação pontual usando Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II sítio-dirigida mutagênese kit, de acordo com as instruções do fabricante. Seqüência de primers podem ser facilmente gerados usando o programa de design online cartilha disponível em: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Nota: Usamos padrão Eppendorf tubos de 1,5 mL no lugar de BD 14 tubos mL descrita no protocolo. No entanto, o uso de XL10-Gold E. ultracompetent coli pré-tratados com β-mercaptoetanol, 30s tempo de choque térmico e NZY + (ou NZYM +) media são críticos para o sucesso mutagênese. Se possível, engenharia de uma mutação adicional silenciosa que cria um site nova restrição pode ser conveniente para a triagem colônias mutantes abaixo. 2. Miniprep, seqüenciamento de DNA e Maxiprep 2,1 Qiagen miniprep e seqüenciamento. Individuais colônias bacterianas são colhidos e cultivados em caldo LB com ampicilina (AMP). Seguimos as instruções do fabricante para purificar o cDNA. Um digest restrição simples pode ser usada confirmar a introdução bem sucedida da mutação, se um sítio de restrição é incorporada no passo 1 acima. Automatizados de seqüenciamento de DNA é feito fora do local, e é essencial para confirmar a presença da mutação no DNA, bem como avaliar se há qualquer mutação indesejada. Este passo é muito importante. Nós seqüência a seqüência GIRK toda codificação usando frente e verso T7 promoter BGH primers de seqüenciamento que o flanco sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo pcDNA3.1. Nota: É importante inspeccionar cuidadosamente o electroferograma seqüenciamento suficiente para garantir a qualidade dos dados de seqüenciamento. Electroferograma de alta qualidade tem nítidas, sem sobreposição picos com ruído de fundo pouco. 2,2 maxiprep Qiagen. Seguimos as instruções do fabricante. Nota: Esta etapa é incluída em nossos experimentos para melhorar a pureza do cDNA, o que encontramos é importante para a transfecção eficiente. 3. Cultura e transfecção de células HEK293T Todas estas etapas devem ser feitas em uma capa estéreis de cultura de tecidos. 3,1 de cultura de células HEK293T células são fáceis de usar, porque eles são fáceis de cultura (37 ° C, 5% CO 2 incubadora umidificada), tem tempo de replicação rápida, a eficiência de transfecção alta e são passíveis de células inteiras eletrofisiologia patch-clamp. Células HEK293T expressar SV40 antígeno T grande que garante a replicação epissomal de pcDNA3.1 plasmídeo. HEK293T células são cultivadas em baixa de glicose DMEM meio suplementado com L-glutamina e 10% soro fetal bovino (FBS). Para as células passaging, adicionar 0,25% de tripsina / EDTA para as células confluentes (90-95%) HEK293T, espere até que as células destacar do prato tecido, então pare a atividade da enzima através da adição de novas mídias contendo FBS /. Placa ~ 1 X 10 5 células / poço em uma placa de cultura de células de 12 poços, juntamente com 1 mL de mídia livre de antibióticos cultura por poço. (1 X 10 5 células é de aproximadamente 350 mL de suspensão de células obtidas a partir frasco T25 confluentes ressuspendido com 10 mL de mídia). 3,2 Transfection Após 24/08 horas, as células HEK irá aderir ao plástico e estão prontos para transfecção. Transfecção de células com 0,2 mg canal cDNA, 0,4 g M2R YFP mg receptor cDNA e 0,04 cDNA usando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: usamos uma pequena quantidade de cDNA YFP para determinar quais células são sucesso transfectadas (células verdes provavelmente irá conter ambos os canais GIRK e receptores M2). A concentração de cDNA de usar terá de ser ajustada para cada clone. 3,3 visualização de fluorescência de células transfectadas. Coloque placa de 12 bem no palco de um microscópio invertido de fluorescência, e examinar as células de expressão YFP. Compare a imagem DIC e anote o número aproximado de células verde. Esta fornece uma estimativa da eficiência de transfecção. 3,4 Preparação de 24 poços pratos e Poly-D-lisina lamínulas revestido Limpa 12 milímetros desliza tampa de vidro (Warner, CS-12R), agitando-los durante a noite com Radiacwash, seguido por lavagem com água deionizada e agitação durante a noite em etanol 95%. Armazenar as lamínulas limpa em etanol 70% até o uso. Lugar lamínulas em placas de Petri com etanol, chama off etanol utilizando fórceps e gravador, umd lugar em um poço de uma placa 24 estéril também. Cobrir todos os poços com 250 mL de poli-D-lisina (PDL) solução [0,2 mg / mL] e deixe o lamínulas se sentar durante a noite imersos em solução PDL sob o capô estéril. Enrole a placa de 24 poços em Parafilm para evitar a evaporação. Na manhã seguinte, aspire PDL e lavar 2x com água estéril. Deixe placas aberta para secar sob o capô, em seguida, cobrir. Os 24 pratos bem com lamínulas revestido pode ser embrulhado com papel de alumínio esterilizado e armazenado em temperatura ambiente por semanas. 3,5 Plating células transfectadas HEK293T na capa desliza 24h após a separação de transfecção, as células em 24 bem-prato (~ 4 X 10 3 células / poço) contendo tampa de vidro desliza revestidas com poli-D-lisina. Nota: as células transfectadas pode ser usado até 24-72 transfecção pós hrs. As células são divididas para fornecer lamínulas individuais para correção experimento de eletrofisiologia grampo. 4. Eletrofisiologia Preparando 4,1 Solutions Solução (banho) extracelular: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e 10 mM HEPES (pH 7,4 set com NaOH). Alíquota de solução de banho de 20K e adicionar moduladores apropriado <ul><li> 20K + Ba 2 +: solução contendo 1 mM BaCl 2: um inibidor específico da retificação dentro correntes </li><li> 20K + carbacol: solução com 5 mM carbacol: um agonista M2R específicos; casais M2R a G-proteínas que canais abertos GIRK </li><li> 20K + Etanol: solução de banho, contendo 100 mM EtOH para ativar canais GIRK diretamente </li></ul> Coloque soluções banho em seringas (contentores solução) do sistema de troca rápida de perfusão. Nota: Nós usamos um sistema de válvula Warner pitada de controlar as soluções de banho. Tubulação de PE é recomendado. Eletrodo solução interna /: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4) com 2,5 mM K 2 ATP e 0,3 mM Li 2 GTP. Nós fazemos a solução do eletrodo sem ATP e GTP. Nós separadamente preparar alíquotas de ATP e GTP, que são armazenadas a -80 ° C, e adicionar à solução de eletrodos no dia do experimento. Mantemos seringa com a solução final sobre eletrodo de gelo para preservar o ATP / GTP. Nós filtro estéril (0,2 mm) as soluções interno / externo para inibir o crescimento microbiano e reduzir a possibilidade de entupimento dos tubos eo eletrodo. 4,2 eletrodos Pulling Usamos Narishige extrator de duas etapas vertical e eletrodo de vidro de borosilicato da Warner Instrumento (1,5 mm de diâmetro externo, 0,86 mm de diâmetro interno e 7,5 cm de comprimento) para obter eletrodos com 3-7 mohms de resistência quando preenchido com solução intracelular. Nota: É necessário determinar experimentalmente os parâmetros para o puxador de eletrodo e do tipo de vidro do eletrodo em seu laboratório. Para o nosso puxador vertical, usamos uma configuração de calor de 60,2 para a primeira puxada e ~ 43 para a atração segundo. 4,3 Whole-cell patch de fixação <ol><li> Montagem tampa de deslizamento em um prato de 35 milímetros usando pequena quantidade de vaselina, cubra com solução externa e antena lugar no palco de um microscópio invertido de fluorescência. Use DIC para se concentrar e encontrar células, mudar para YFP fluorescência para localizar YFP células positivas. </li><li> Ponta posição do colector de perfusão perto de uma célula verde (20-30 M a partir da célula de interesse comprimento celular = 2-3 intervalo). </li><li> Preencha eletrodos com solução, anexá-lo ao headstage de Axopatch amplificador 200B (Axon Instruments) com as seguintes configurações iniciais: Ganhe 1, Configuração: conjunto de células β = 1, o modo V-clamp. </li><li> Aplique uma pressão positiva sobre eletrodo para evitar o entupimento da pipeta, e usar o manipulador de colocar ponta do eletrodo apenas acima da célula. </li><li> Para o potencial Zero pipeta, selecione o botão de teste Seal para entregar um passo tensão de teste. A tensão de 5 mV passo retangular aparecerá na janela de teste Selo de Clampex. Ajuste o potenciômetro Pipetar offset do amplificador para trazer a linha de base atual a 0 nA. Alternativamente, zero o potencial pipeta mudando o modo de amplificador seletor para V-track modo eo botão medidor para Vtrack e utilizar o potenciômetro Pipetar offset do amplificador para elevar a tensão no visor metros amplificador para "0.00". </li><li> Verifique a resistência do eletrodo usando o comando selo teste do 8,2 Clampex software (deve ser mohms 07/03). </li><li> Abrir um arquivo salvo protocolo ou criar um novo protocolo. Para abrir o arquivo protocolo selecionar no menu principal Adquirir Protocolo, em seguida, Abrir e escolha um arquivo salvo protocolo de tensão. Para este experimento, o protocolo foi criado para conter o potencial de membrana de-40mV, entregar um único passo de tensão 50 ms a -100 mV e 40 mV rampa de acesso para mais de 200 ms. Este protocolo é executado a cada 2 segundos. O protocolo de rampa permite a observação da rectificação reversão em potencial e para dentro de canais GIRK. Para os canais iónicos dependentes de voltagem, um degrau de tensão retangular pode ser mais apropriado. </li><li> Célula abordagem utilizando o ajuste fino do manipulador, a liberação de pressão positiva, depois de tocar a superfície da célula aplicar pressão negativa, e monitorar aumento da resistência na janela osciloscópio Seal Test. Uma vez que a resistência está na faixa GÊ, o eletrodo foi selado membrana (Gigaseal formou). </li><li> Aplicar um pulso de pressão negativa para quebrar a membrana celular e tenha acesso na célula. Uma vez em toda a configuração de célula, você irá registrar aumento correntes capacitivas. </li><li> Mude para o Teste de Membrana em Clampex e anote o acesso a resistência Ra, Rm resistência da membrana, Cm capacitância de membrana e verificar pelo olho do ajuste exponencial da curva teórica para a corrente capacitiva reais. Capacitância da membrana é proporcional ao tamanho da célula e serão utilizadas posteriormente para calcular a densidade de corrente. </li><li> Voltar para o Selo de teste, conjunto V-Out (potencial de membrana) a -40 mV e filtro de 10 kHz </li><li> Compensar a capacitância de membrana e resistência em série no amplificador com as seguintes etapas: <ol class="lalpha"><li> Mudar o interruptor CAP TODO celular. Ajuste CAP células inteiras e mostradores resistência em série e para trás, até obter um pulso de teste plana. Você também pode precisar de ajustar capacitância pipeta botão CAP FAST. </li><li> Ligue o botão PREVISÃO% para cerca de 60-80%, novamente re-ajustando CAP células inteiras ea marcação resistência em série (você pode ter que ajustar a compensação de capacitância pipeta botão CAP rápido também). </li><li> Ligue% COMP-a 100%, sem oscilação da célula, enquanto tenta manter o pulso flat reajustando CAP células inteiras e resistência em série (você pode ter que ajustar a compensação de capacitância pipeta botão CAP rápido também). Ajustar o lag, reduzindo o tempo constante. </li><li> Anote os valores de Cm (capacitância de membrana), Rs (resistência em série), COMP%, PRED% e tempo de atraso definido no amplificador no notebook. O Cm e Rs deve ser aproximadamente o mesmo que o Cm e Rm medido no teste de membrana acima. </li></ol></li><li> Ligue válvula solução externa para controlar a solução do banho. Definir o amplificador de 8 pólos do filtro de Bessel de 2kHz, abra um protocolo de fixação de tensão e correntes começar a gravação. </li><li> Gravamos correntes GIRK usando um protocolo de rampa que os passos a -100 mV para 50 ms, em seguida, rampas de 100 mV a 40 mV mais de 200 ms e é entregue a cada 2 segundos. O protocolo de rampa permite a observação do potencial de reversão e de propriedade de retificação para dentro de canais GIRK. À temperatura ambiente (22-25 ° C), o GIRK atual deve reverter perto -50 mV (com 20 mM KCl no banho), que está perto do potencial de equilíbrio calculado para K (E K = -50 mV), então permanecem bastante plana em potenciais positivos para E-K. </li><li> Protocolo experimental: Após a gravação de uma linha de base estável, mude para solução de 20K + carbacol e aguarde pico de resposta, voltar para 20K solução de banho, em seguida, aplicar 20K + Etanol e aguardar resposta de pico, em seguida, mudar para 20K solução do banho e, finalmente, 20K + Ba 2 + solução. Durante a aplicação destas drogas você verá mudanças na amplitude de GIRK correntes (mais pronunciada a -100 mV). Anote o número do traço correspondente à aplicação de diferentes soluções extracelular no notebook. Um arquivo Clampfit único conterá todas as varreduras em busca de todo o experimento. </li></ol> 5. Análise de Dados Usamos Clampfit software 9.2 para analisar os dados correntes GIRK a -100 mV. <ol><li> Abra o arquivo com a gravação, conjunto cursor a -100 mV. Por padrão, você verá todos os traços sobrepostos na tela. Ao pressionar "Write cursores" ícone que você irá criar Excel-como planilha com dados numéricos. </li><li> Através da atribuição de X para a coluna número de rastreamento e Y para a coluna de cursor e pressionando "Criar Gráfico" ícone você pode rapidamente desenhar um gráfico tempo-curso do experimento. </li><li> Calcular corrente basal subtraindo atual em presença de Ba 2 + a partir de corrente registou em solução de perfusão externo sozinho ("20K atual" minus "20K + Ba 2 + atual"). Calcular as correntes induzidas subtraindo atual basal em 20K das correntes ativadas ("20K + carbacol atual" minus "20K atual", "Etanol 20K + atual" minus "20K atual"). Calcular a densidade de corrente (pA / pF) dividindo-se a corrente pela capacitância de membrana (leia-se directamente a partir do amplificador). Calcular a ativação por cento dividindo correntes induzidas por correntes basal e multiplicando por 100. </li></ol> 6. Resultados representante Você deve ser capaz de registro atual a partir de células transfectadas com canais do tipo selvagem. Para GIRK medida canaisd na solução extracelular contendo 20 mM K + (e 145 mM K + intracelular) que deve apresentar retificação interna forte e um potencial de reversão de ~ -50 mV, que é uma propriedade essencial de canais de potássio. A corrente do tipo selvagem vai aumentar fortemente sobre carbacol aplicação (3-5 vezes ao longo aumentar atual basal) e responder de forma semelhante ao etanol 100 mM. Nota: a convenção de sinais para eletrofisiologia é que a corrente é negativa para dentro e para fora atual é positivo. Para a mutação L257W no bolso álcool ligação de GIRK2, você vai ver as respostas atenuadas a ambos carbacol e etanol. Isto sugere que a L 257 está envolvido em álcool e ativação da proteína G de GIRK2 canais. Para mais exemplos dos resultados da GIRK2 mutagênese, consulte a publicação recente de Aryal et al. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Janela de 8,0 Clampfit arquivo de dados para shows do tipo selvagem de gravação GIRK2. Painel superior esquerdo mostra sobreposta registros gravados em resposta a um protocolo de rampa de tensão na presença de diferentes soluções externas bah. Cursor é posicionado em um -100 mV. Os valores de cursor são escritos para a planilha (painel direito). Painel inferior esquerdo mostra o gráfico do número de varredura contra, atual. Observe o aumento da corrente (deflexão para baixo) com etanol (EtOH) e carbacol (Carb) e inibição atual com Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Descrições de janela de 8,0 Clampfit arquivo de dados para uma gravação mostra GIRK2-L257W mutante. São os mesmos que na Figura 1. Observe a perda de carbacol ativação (Carb) e redução de EtOH induzida por correntes nos canais de mutantes.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Sítio-dirigida mutagênese é uma abordagem clássica para estudar as relações estrutura-função de canais iônicos. Ele é baseado na premissa de que mudando um resíduo crítico do canal iônico deve ser capaz de observar as mudanças pronunciadas na função de canal. Em contraste, muitas mutações na posição de não-críticas podem ser introduzidas sem perturbações importantes para a função de canal. Normalmente, o resíduo em questão é o primeiro mutante a alanina, um ácido não-polar pequena amino, seguida por mutações triptofano, o maior de aminoácidos 2. Se o resíduo é importante para a função de canal, ambas as mutações modifica a atividade do canal. Se um resíduo menos essencial é mutante, os efeitos da mutação, especialmente a alanina são muitas vezes banal. Triptofano mutações são mais propensos a provocar alterações devido a impedimentos estéricos associados com o tamanho do triptofano. Muitas vezes, quando a informação estrutural está faltando mutação, sistemática para alanina ou triptofano dentro de um fragmento do canal (chamado alanina ou triptofano scan) pode ser usado para localizar os resíduos críticos. É importante notar que vários clones com diferentes mutações pontuais podem ser preparadas em paralelo permitindo testes de resíduos múltiplos dentro de um prazo relativamente curto. Recentemente, várias estruturas cristalinas dos canais tornaram-se disponíveis 3,4,5. Elas podem ser usadas para propor possíveis resíduos de chave a ser testada utilizando a abordagem descrita neste protocolo. Medições em tipo selvagem canal deve sempre acompanhar a medição de um canal de mutantes para servir como um controle positivo para assegurar que os experimentos de transfecção e eletrofisiológicas foram feitas corretamente. Mutações pontuais pode levar à falta de uma corrente funcional, semelhante à atual regulamentação do tipo selvagem ou alterados da atividade do canal. Falta de corrente mensurável pode ser devido ao tráfico de dobrar ou alterados impróprio. Nesse caso, pode ser útil para descobrir se o canal de tráfegos corretamente para a superfície através de um ensaio Biotinilação ou imunofluorescência contra tag extracelular (sem permeabilização celular) para distinguir entre não-funcionais canais na membrana plasmática e canais retidos no interior da célula . Finalmente, é aconselhável investigar não apenas a atividade basal do canal, mas também as consequências da mutação sobre a regulamentação do canal. Diferentes mecanismos de modulação da função de canal poderia ser estudada, dependendo do canal de íon de interesse, incluindo regulação por proteínas G, PIP2, íons, a concentração de ATP, a fosforilação (usando serina tirosina, treonina ou mutação), ubiquitinação ou sumoylation (através de mutação de lisina) e abridores de canal direto ou bloqueadores.

<table><tbody><tr><td>Produtos químicos</td><td>Sigma</td><td>Varia</td><td></td></tr><tr><td>Kit Mini Prep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina hidrobrometo</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Poli-L-lisina também pode ser utilizada</td></tr><tr><td>Kit Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>Kit QuickChange XL II de Mutagênese Direcionada por Sítio</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidro borossilicato - parede padrão</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;Microscópio invertido de fluorescência&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Eletrofisiologia</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>Qualquer microscópio invertido DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;com fluorescência</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Amplificador Axon Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusão</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusion MM-6</td><td></td></tr><tr><td>Conversor digital</td><td>Molecular Devices</td><td>Conversor Digidata 1320</td><td></td></tr><tr><td>Manipuladores</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipulador: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de eletrodos</td><td>Narishige</td><td>Puxador vertical de eletrodos PC10</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de isolamento</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Mesa pneumática</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagênese e análise funcional de canais iônicos heterologously expresso em células de mamíferos

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Vamos demonstrar como estudar os efeitos funcionais da introdução de uma mutação pontual em um canal iônico. Estudamos proteína G-gated de potássio dentro de retificação (referido como GIRK) canais, que são importantes para a regulação da excitabilidade dos neurônios. Há quatro diferentes subunidades GIRK mamíferos canal (GIRK1-GIRK4) - nos concentramos em GIRK2 porque forma uma homotetramer. A estimulação de diferentes tipos de G receptores acoplados à proteína (GPCRs), tais como os receptores muscarínicos (M2R), leva à ativação de canais GIRK. O álcool também ativa diretamente os canais GIRK. Vamos mostrar como a mutar um aminoácido por especificamente alterando um ou mais nucleotídeos no cDNA para o canal GIRK. Esta seqüência mutada cDNA será amplificado em bactérias, purificado, ea presença da mutação de ponto será confirmada por seqüenciamento de DNA. Os cDNAs para os canais de mutantes e do tipo selvagem GIRK serão transfectadas em células embrionárias do rim HEK293T cultivadas in vitro. Por último, de célula inteira patch-clamp eletrofisiologia será usado para estudar as correntes macroscópicas de potássio através da ectopicamente expressa canais GIRK do tipo selvagem ou mutado. Nesta experiência, vamos examinar o efeito de uma mutação no L257W GIRK2 canais na ativação M2R-dependentes e dependentes de álcool.

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Demonstraremos como estudar os efeitos funcionais da introdução de uma mutação pontual em um canal iônico. Estudamos canais retificadores inwards dependentes de proteína G...

Os canais de potássio retificadores internos ativados por proteína G, ou grk, são importantes para regular a excitabilidade dos neurônios. Os grk podem ser ativados por receptores acoplados à proteína G (GPCRs), como o receptor muscarínico M2R, e pelo álcool, para estudar os efeitos de mutações no sítio de ligação do álcool no gerk. Após sua ativação, uma mutação pontual é introduzida no DNAc do grk por mutagênese direcionada a sítios; construtos purificados de gerk são transfectados, juntamente com construtos de YFP, em células de mamíferos, e a eficiência de transfeção é avaliada por imagem de fluorescência.A análise por grampo de patch em células inteiras é então realizada para comparar a ativação dependente de álcool e de proteína G. Esta demonstração experimental visual fornecerá informações essenciais sobre como estudar a função dos canais LY. Hoje analisaremos a questão de como o álcool ativa os canais do grupo.A técnica de neogênese direcionada a sítios mostrada aqui pode fornecer informações sobre a função de canais iônicos. Esta técnica também pode ser aplicada a outros sistemas nos quais se sabe que uma mutação em um gene causa doença humana. Essas são demonstrações da técnica de patch clamp em células quentes, sendo crítica porque há muitas etapas que exigem precisão, compensação eletrônica adequada e prática para gerar dados utilizáveis.O DNA utilizado para transfeção neste protocolo é preparado da seguinte forma. Primeiro, a subunidade GRK, o DNA proveniente da PCR é diretamente clonado no plasmídeo de expressão mamífera. Pontos de mutação no DNA do plasmídeo PC 3.1 são introduzidos utilizando primers adequadamente projetados juntamente com o kit de mutagênese direcionada em dois sítios Quick Change XL.Utilizando este sistema, é realizada uma PCR na qual todo o plasmídeo é replicado, e mutações pontuais codificadas pelos iniciadores são introduzidas. Após a PCR, os plasmídeos replicados são digeridos com a enzima de restrição DPN I e, em seguida, transformados por choque térmico em *E. coli* XL10-Gold ultracompetentes. As bactérias transformadas são cultivadas em placas de ágar LB com ampicilina; bactérias que abrigam o plasmídeo são resistentes à ampicilina e formarão colônias.As colônias isoladas são selecionadas e cultivadas em culturas miniatura. São realizados mini-preps para isolar o DNA plasmidial. O DNA é então sequenciado para identificar mutantes com transformação bem-sucedida.E. coli são cultivadas em um lote maior e são realizadas preparações em larga escala para obter quantidades maiores de DNA plasmidial. Plaque cerca de uma vez 10 elevado a cinco células HEC 293T em cada um dos dois poços de uma placa de 12 poços, um para a mutante e outro para o controle. Incube o canal selvagem a 37 graus Celsius.Após oito a 24 horas, as células aderirão ao seu substrato e estarão prontas para transfeção. Transfete as células com lipo 2000 de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 0,2 microgramas de cDNA do canal, 0,4 microgramas de cDNA do receptor M2R e 0,04 microgramas de YFP-cDNA. Para identificar células transfectadas com sucesso, incube as células por 24 horas.Após o tempo desejado de incubação ter decorrido, coloque as células na platina de um microscópio de fluorescência invertido para determinar a eficiência de transfeção. Compare as imagens fluorescentes e as imagens de contraste de fase para determinar a porcentagem de células transfectadas. Devolva a placa de cultura ao incubador.Lave lamínulas de vidro de 12 milímetros e armazene-as em etanol até o uso. Remova o etanol residual por meio de chama no gabinete estéril. Coloque as lamínulas em uma placa de 24 poços e recubra-as com 0,2 miligramas por mililitro.Polilisina 24 horas após a transfeção, trypsiniza as células e placa quatro vezes 10 elevado a três células por poço. Em quatro a oito poços de uma placa de 24 poços contendo lamínulas de vidro revestidas com polilisina, incuba por mais 24 a 48 horas antes de realizar o registro em modo "whole-cell". Prepara os eletrodos de grampo usando um puxador vertical de dois estágios e vidro borossilicato para eletrodos.Idealmente, o eletrodo finalizado deverá ter uma resistência de três a sete megaohms e não exigirá manipulação adicional, como polimento a calor. Para o patch clamping, coloque um lamínula com células transfectadas em uma placa de 35 milímetros contendo solução externa de potássio 20 milimolar ou 20 K. Coloque a placa sobre a platina de um microscópio invertido de fluorescência.O sistema de grampo de membrana utilizado aqui emprega um sistema de perfusão. Esse sistema contém as soluções extracelulares que serão aplicadas às células, as quais são alimentadas por gravidade através de tubos conectados a uma tubulação múltipla. Cada solução é controlada remotamente por uma válvula solenoide de pinçamento.Utilize contraste de interferência diferencial (DIC) para focalizar e localizar as células. Alterne para o filtro YFP para identificar as células positivas para YFP. Após identificar as células positivas para YFP, posicione a ponta do sistema de perfusão próximo à célula neurofluorescente, a uma distância de 20 a 30 mícrons ou dois a três comprimentos celulares.Preencha um eletrodo com solução interna para eletrodo. Usando uma seringa e uma agulha flexível, toque suavemente no eletrodo cheio para remover bolhas de ar da ponta. Conecte os eletrodos ao estágio de cabeça de um amplificador AXO patch 200 B.Verifique novamente se as configurações no amplificador correspondem a uma configuração. O interruptor de célula inteira está em beta igual a um, e o filtro passa-baixa está ajustado em 10 quilohertz. Aplique pressão positiva com a seringa e o grampo para manter a ponta do eletrodo limpa.Em seguida, utilize um micromanipulador para posicionar a ponta do eletrodo no banho e mova-se para acima da célula. Altere o amplificador para o modo V track e o botão do medidor para V track. Em seguida, utilize o medidor de potencial de offset da pipeta no amplificador para zerar o potencial da pipeta, ajustando a tensão no visor do medidor do amplificador para 0,00.Alternativamente, mude para o modo de clamp de voltagem no amplificador e selecione o botão de pulso de teste para aplicar um degrau de voltagem de teste. O degrau de voltagem retangular aparecerá na janela de teste de selamento do clamp. Ajuste o offset da pipeta no amplificador para trazer a corrente de linha de base a zero nanoampères.O teste de selamento mostrará a resistência do eletrodo, que deve ser de três a sete megaohms. Em seguida, feche a janela do teste de selamento. Selecione adquirir protocolo aberto no menu suspenso.Em seguida, selecione um protocolo de voltagem salvo. Aqui, o protocolo selecionado foi previamente programado para aplicar um único degrau de voltagem de menos 100 milivolts e rampa até mais 40 milivolts a cada dois segundos. Esse protocolo de rampa permite a observação do potencial de reversão e da propriedade de retificação interna dos canais GK.Para canais iônicos ativados por voltagem, um degrau retangular de voltagem pode ser mais apropriado, utilizando o ajuste fino do micromanipulador para se aproximar da célula, liberar a pressão positiva e, após tocar a superfície celular, aplicar uma leve pressão negativa. Monitore o aumento resultante na resistência no teste de selamento. Uma vez que a resistência esteja na faixa de gigaohm, o eletrodo terá selado à membrana.Isso é chamado de selo gigohm. Usando uma seringa, aplique um pulso de pressão negativa para romper a membrana e obter acesso à célula. Uma vez na configuração de célula inteira, o teste de selo registrará grandes correntes capacitivas que são visíveis como picos ou transientes no início e no final do teste.Pulso no teste de vedação. Em seguida, clique no botão de teste da membrana. No clamp X, registre a resistência de acesso e a resistência da membrana.Uma capacitância da membrana em um caderno verifica visualmente o ajuste exponencial. A capacitância da membrana é proporcional ao tamanho da célula e será usada para calcular a densidade de corrente acessória. A resistência e a resistência da membrana são utilizadas para avaliar se a gravação será satisfatória para a continuação.Uma boa gravação terá uma baixa resistência de acesso. Agora feche a janela de teste da membrana e clique novamente no botão de teste de selamento na janela de teste de selamento; defina V para menos 40 milivolts para compensar a capacitância da membrana e a resistência em série no amplificador, ligue o modo de célula inteira, ajuste o compensador de célula inteira e a resistência em série para frente e para trás até que o transitório seja minimizado e a corrente se torne uma linha plana. Se necessário, ajuste a capacitância da pipeta com o botão de compensação rápida no amplificador.Uma compensação excessiva ou insuficiente deixará um transitório de capacidade residual. Em seguida, gire o botão de porcentagem de predição para 60 a 80% e reajuste a resistência em série da capacidade da célula inteira e a capacidade rápida conforme necessário para obter uma linha plana no teste de selamento. Por fim, gire a compensação percentual para cerca de 100% sem oscilar a célula, tentando ao mesmo tempo manter o pulso o mais linear possível mediante o reajuste dos potenciômetros de resistência em série da capacidade da célula inteira e da capacidade rápida.Uma vez alcançada a compensação de resistência e capacitância, anote em um caderno o valor definido para o percentual de resistência série de capacitância do amplificador, o percentual de compensação previsto e o tempo de atraso, ligue a válvula da solução externa para a solução de banho controle 20 K. Ajuste o filtro do vaso passa-baixas no amplificador para dois quilohertz. Em seguida, inicie a gravação das correntes clicando no botão de gravação no software.Procure a propriedade de retificação interna da corrente ger. Isso é observado como uma corrente interna grande negativa em relação ao potencial de reversão do potássio, determinado pela equação de Nernst EK, e uma corrente externa pequena positiva em relação a ek. Após registrar uma linha de base estável, determine a ativação mediada por receptor das correntes aplicando a solução extracelular 20 k mais carbacol.Após a observação da ativação máxima e quando a corrente atingir o estado estacionário, retorne à solução de banho com K e aguarde até que o nível de corrente basal seja alcançado. Em seguida, para estudar a ativação por álcool das correntes gert, mude para a solução externa com 20 k mais 100 milimolares de etanol e aguarde a resposta de pico.Em seguida, retorne à solução de banho com 20 K e aguarde até que o nível de corrente basal seja alcançado. Por fim, para determinar as correntes basais de gert, mude para a solução de 20 K mais 20 K de bário e aguarde a resposta neste ponto. A inibição da corrente gerk deve ser evidente, sendo mais acentuada em menos 100 milivolts ao longo de todo o procedimento.Observe o número da varredura correspondente à aplicação de diferentes soluções extracelulares. Um único arquivo de ajuste de clamp conterá todas as varreduras para todo o experimento. Para analisar os dados de GK, utilize o software ClampFIT 8.2.De acordo com as instruções no protocolo escrito anexo, foram obtidas duas gravações diferentes em larga escala de células HEC 2 9 3 T expressando canais GK do tipo selvagem ou mutantes e analisadas conforme as instruções deste vídeo, conforme mostrado aqui para o GK tipo selvagem dois. O painel à esquerda contém uma janela com várias correntes sobrepostas que foram produzidas pelo protocolo de rampa de voltagem na presença de diferentes soluções. Observe a retificação interna.Essa é a corrente interna maior em menos 100 milivolts por volta de 50 milissegundos no traçado da corrente. A pequena corrente externa entre zero e mais 40 milivolts por volta de 200 a 260 milissegundos no traçado da corrente origina-se de um canal de potássio endógeno regulado por voltagem. Não é a corrente Gert cursor.Um é colocado sobre a corrente inativa máxima, e os valores do cursor são registrados na planilha. Na planilha, o número do traçado e a corrente em menos 100 milivolts são observados.Os dados incluem corrente basal, correntes induzidas por carbacol e evocadas por álcool, bem como uma corrente inibida por bário. Da mesma forma, as correntes em rampa de voltagem na presença de diferentes soluções. 20 k mais 100 milimolares de etanol ou 20 k mais cinco milimolares de carbacol ou 20 k mais bário são mostrados para o canal mutante L 2 57 w.Observe as correntes significativamente menores induzidas por álcool e carbo álcool. Esses achados sugerem que esse resíduo desempenha um papel importante no controle da abertura dos canais GK pelo álcool e pelas subunidades gama g e beta. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir uma mutação em um e iniciar, bem como estudar seu efeito na função do canal utilizando técnicas eletrofisiológicas avançadas.Uma vez dominada, essa técnica de neogênese direcionada pode ser realizada em dois a três dias e ampliada para cinco ou mais mutações. O desenvolvimento dessas técnicas abriu caminho para que os biofísicos de canais iônicos explorem as propriedades básicas da função e do comportamento dos canais iônicos. Além disso, permitem aos pesquisadores estudar as doenças humanas causadas por uma única mutação em um gene de canal iônico.

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

A primeira parte deste artigo mostra como selecionar linhagens celulares mutantes que expressam trocadores vesiculares de Na+/H+ em sua membrana plasmática. A segunda parte fornece protocolos baseados em medições de pH intracelular e rápida absorção de íons, que são usados para determinar a seletividade de íons e os parâmetros cinéticos desses trocadores.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Este protocolo descreve um método para o estudo de proteínas de membrana eletrogênicas através da medição de mudanças no potencial de membrana. Este ensaio fornece uma plataforma para a leitura funcional de múltiplos canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais.

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

O direcionamento farmacológico dos canais iônicos é uma abordagem promissora para o tratamento de tumores sólidos. Protocolos detalhados são fornecidos para caracterizar a função de canais iônicos em células cancerosas e avaliar os efeitos de moduladores de canais iônicos na viabilidade do câncer.

Rastreamento de Canais Iônicos em Células Cancerosas

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