Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Os canais de potássio retificadores internos ativados por proteína G, ou grk, são importantes para regular a excitabilidade dos neurônios. Os grk podem ser ativados por receptores acoplados à proteína G (GPCRs), como o receptor muscarínico M2R, e pelo álcool, para estudar os efeitos de mutações no sítio de ligação do álcool no gerk. Após sua ativação, uma mutação pontual é introduzida no DNAc do grk por mutagênese direcionada a sítios; construtos purificados de gerk são transfectados, juntamente com construtos de YFP, em células de mamíferos, e a eficiência de transfeção é avaliada por imagem de fluorescência.

A análise por grampo de patch em células inteiras é então realizada para comparar a ativação dependente de álcool e de proteína G. Esta demonstração experimental visual fornecerá informações essenciais sobre como estudar a função dos canais LY. Hoje analisaremos a questão de como o álcool ativa os canais do grupo.

A técnica de neogênese direcionada a sítios mostrada aqui pode fornecer informações sobre a função de canais iônicos. Esta técnica também pode ser aplicada a outros sistemas nos quais se sabe que uma mutação em um gene causa doença humana. Essas são demonstrações da técnica de patch clamp em células quentes, sendo crítica porque há muitas etapas que exigem precisão, compensação eletrônica adequada e prática para gerar dados utilizáveis.

O DNA utilizado para transfeção neste protocolo é preparado da seguinte forma. Primeiro, a subunidade GRK, o DNA proveniente da PCR é diretamente clonado no plasmídeo de expressão mamífera. Pontos de mutação no DNA do plasmídeo PC 3.1 são introduzidos utilizando primers adequadamente projetados juntamente com o kit de mutagênese direcionada em dois sítios Quick Change XL.

Utilizando este sistema, é realizada uma PCR na qual todo o plasmídeo é replicado, e mutações pontuais codificadas pelos iniciadores são introduzidas. Após a PCR, os plasmídeos replicados são digeridos com a enzima de restrição DPN I e, em seguida, transformados por choque térmico em *E. coli* XL10-Gold ultracompetentes. As bactérias transformadas são cultivadas em placas de ágar LB com ampicilina; bactérias que abrigam o plasmídeo são resistentes à ampicilina e formarão colônias.

As colônias isoladas são selecionadas e cultivadas em culturas miniatura. São realizados mini-preps para isolar o DNA plasmidial. O DNA é então sequenciado para identificar mutantes com transformação bem-sucedida.

E. coli são cultivadas em um lote maior e são realizadas preparações em larga escala para obter quantidades maiores de DNA plasmidial. Plaque cerca de uma vez 10 elevado a cinco células HEC 293T em cada um dos dois poços de uma placa de 12 poços, um para a mutante e outro para o controle. Incube o canal selvagem a 37 graus Celsius.

Após oito a 24 horas, as células aderirão ao seu substrato e estarão prontas para transfeção. Transfete as células com lipo 2000 de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 0,2 microgramas de cDNA do canal, 0,4 microgramas de cDNA do receptor M2R e 0,04 microgramas de YFP-cDNA. Para identificar células transfectadas com sucesso, incube as células por 24 horas.

Após o tempo desejado de incubação ter decorrido, coloque as células na platina de um microscópio de fluorescência invertido para determinar a eficiência de transfeção. Compare as imagens fluorescentes e as imagens de contraste de fase para determinar a porcentagem de células transfectadas. Devolva a placa de cultura ao incubador.

Lave lamínulas de vidro de 12 milímetros e armazene-as em etanol até o uso. Remova o etanol residual por meio de chama no gabinete estéril. Coloque as lamínulas em uma placa de 24 poços e recubra-as com 0,2 miligramas por mililitro.

Polilisina 24 horas após a transfeção, trypsiniza as células e placa quatro vezes 10 elevado a três células por poço. Em quatro a oito poços de uma placa de 24 poços contendo lamínulas de vidro revestidas com polilisina, incuba por mais 24 a 48 horas antes de realizar o registro em modo "whole-cell". Prepara os eletrodos de grampo usando um puxador vertical de dois estágios e vidro borossilicato para eletrodos.

Idealmente, o eletrodo finalizado deverá ter uma resistência de três a sete megaohms e não exigirá manipulação adicional, como polimento a calor. Para o patch clamping, coloque um lamínula com células transfectadas em uma placa de 35 milímetros contendo solução externa de potássio 20 milimolar ou 20 K. Coloque a placa sobre a platina de um microscópio invertido de fluorescência.

O sistema de grampo de membrana utilizado aqui emprega um sistema de perfusão. Esse sistema contém as soluções extracelulares que serão aplicadas às células, as quais são alimentadas por gravidade através de tubos conectados a uma tubulação múltipla. Cada solução é controlada remotamente por uma válvula solenoide de pinçamento.

Utilize contraste de interferência diferencial (DIC) para focalizar e localizar as células. Alterne para o filtro YFP para identificar as células positivas para YFP. Após identificar as células positivas para YFP, posicione a ponta do sistema de perfusão próximo à célula neurofluorescente, a uma distância de 20 a 30 mícrons ou dois a três comprimentos celulares.

Preencha um eletrodo com solução interna para eletrodo. Usando uma seringa e uma agulha flexível, toque suavemente no eletrodo cheio para remover bolhas de ar da ponta. Conecte os eletrodos ao estágio de cabeça de um amplificador AXO patch 200 B.

Verifique novamente se as configurações no amplificador correspondem a uma configuração. O interruptor de célula inteira está em beta igual a um, e o filtro passa-baixa está ajustado em 10 quilohertz. Aplique pressão positiva com a seringa e o grampo para manter a ponta do eletrodo limpa.

Em seguida, utilize um micromanipulador para posicionar a ponta do eletrodo no banho e mova-se para acima da célula. Altere o amplificador para o modo V track e o botão do medidor para V track. Em seguida, utilize o medidor de potencial de offset da pipeta no amplificador para zerar o potencial da pipeta, ajustando a tensão no visor do medidor do amplificador para 0,00.

Alternativamente, mude para o modo de clamp de voltagem no amplificador e selecione o botão de pulso de teste para aplicar um degrau de voltagem de teste. O degrau de voltagem retangular aparecerá na janela de teste de selamento do clamp. Ajuste o offset da pipeta no amplificador para trazer a corrente de linha de base a zero nanoampères.

O teste de selamento mostrará a resistência do eletrodo, que deve ser de três a sete megaohms. Em seguida, feche a janela do teste de selamento. Selecione adquirir protocolo aberto no menu suspenso.

Em seguida, selecione um protocolo de voltagem salvo. Aqui, o protocolo selecionado foi previamente programado para aplicar um único degrau de voltagem de menos 100 milivolts e rampa até mais 40 milivolts a cada dois segundos. Esse protocolo de rampa permite a observação do potencial de reversão e da propriedade de retificação interna dos canais GK.

Para canais iônicos ativados por voltagem, um degrau retangular de voltagem pode ser mais apropriado, utilizando o ajuste fino do micromanipulador para se aproximar da célula, liberar a pressão positiva e, após tocar a superfície celular, aplicar uma leve pressão negativa. Monitore o aumento resultante na resistência no teste de selamento. Uma vez que a resistência esteja na faixa de gigaohm, o eletrodo terá selado à membrana.

Isso é chamado de selo gigohm. Usando uma seringa, aplique um pulso de pressão negativa para romper a membrana e obter acesso à célula. Uma vez na configuração de célula inteira, o teste de selo registrará grandes correntes capacitivas que são visíveis como picos ou transientes no início e no final do teste.

Pulso no teste de vedação. Em seguida, clique no botão de teste da membrana. No clamp X, registre a resistência de acesso e a resistência da membrana.

Uma capacitância da membrana em um caderno verifica visualmente o ajuste exponencial. A capacitância da membrana é proporcional ao tamanho da célula e será usada para calcular a densidade de corrente acessória. A resistência e a resistência da membrana são utilizadas para avaliar se a gravação será satisfatória para a continuação.

Uma boa gravação terá uma baixa resistência de acesso. Agora feche a janela de teste da membrana e clique novamente no botão de teste de selamento na janela de teste de selamento; defina V para menos 40 milivolts para compensar a capacitância da membrana e a resistência em série no amplificador, ligue o modo de célula inteira, ajuste o compensador de célula inteira e a resistência em série para frente e para trás até que o transitório seja minimizado e a corrente se torne uma linha plana. Se necessário, ajuste a capacitância da pipeta com o botão de compensação rápida no amplificador.

Uma compensação excessiva ou insuficiente deixará um transitório de capacidade residual. Em seguida, gire o botão de porcentagem de predição para 60 a 80% e reajuste a resistência em série da capacidade da célula inteira e a capacidade rápida conforme necessário para obter uma linha plana no teste de selamento. Por fim, gire a compensação percentual para cerca de 100% sem oscilar a célula, tentando ao mesmo tempo manter o pulso o mais linear possível mediante o reajuste dos potenciômetros de resistência em série da capacidade da célula inteira e da capacidade rápida.

Uma vez alcançada a compensação de resistência e capacitância, anote em um caderno o valor definido para o percentual de resistência série de capacitância do amplificador, o percentual de compensação previsto e o tempo de atraso, ligue a válvula da solução externa para a solução de banho controle 20 K. Ajuste o filtro do vaso passa-baixas no amplificador para dois quilohertz. Em seguida, inicie a gravação das correntes clicando no botão de gravação no software.

Procure a propriedade de retificação interna da corrente ger. Isso é observado como uma corrente interna grande negativa em relação ao potencial de reversão do potássio, determinado pela equação de Nernst EK, e uma corrente externa pequena positiva em relação a ek. Após registrar uma linha de base estável, determine a ativação mediada por receptor das correntes aplicando a solução extracelular 20 k mais carbacol.

Após a observação da ativação máxima e quando a corrente atingir o estado estacionário, retorne à solução de banho com K e aguarde até que o nível de corrente basal seja alcançado. Em seguida, para estudar a ativação por álcool das correntes gert, mude para a solução externa com 20 k mais 100 milimolares de etanol e aguarde a resposta de pico.

Em seguida, retorne à solução de banho com 20 K e aguarde até que o nível de corrente basal seja alcançado. Por fim, para determinar as correntes basais de gert, mude para a solução de 20 K mais 20 K de bário e aguarde a resposta neste ponto. A inibição da corrente gerk deve ser evidente, sendo mais acentuada em menos 100 milivolts ao longo de todo o procedimento.

Observe o número da varredura correspondente à aplicação de diferentes soluções extracelulares. Um único arquivo de ajuste de clamp conterá todas as varreduras para todo o experimento. Para analisar os dados de GK, utilize o software ClampFIT 8.2.

De acordo com as instruções no protocolo escrito anexo, foram obtidas duas gravações diferentes em larga escala de células HEC 2 9 3 T expressando canais GK do tipo selvagem ou mutantes e analisadas conforme as instruções deste vídeo, conforme mostrado aqui para o GK tipo selvagem dois. O painel à esquerda contém uma janela com várias correntes sobrepostas que foram produzidas pelo protocolo de rampa de voltagem na presença de diferentes soluções. Observe a retificação interna.

Essa é a corrente interna maior em menos 100 milivolts por volta de 50 milissegundos no traçado da corrente. A pequena corrente externa entre zero e mais 40 milivolts por volta de 200 a 260 milissegundos no traçado da corrente origina-se de um canal de potássio endógeno regulado por voltagem. Não é a corrente Gert cursor.

Um é colocado sobre a corrente inativa máxima, e os valores do cursor são registrados na planilha. Na planilha, o número do traçado e a corrente em menos 100 milivolts são observados.

Os dados incluem corrente basal, correntes induzidas por carbacol e evocadas por álcool, bem como uma corrente inibida por bário. Da mesma forma, as correntes em rampa de voltagem na presença de diferentes soluções. 20 k mais 100 milimolares de etanol ou 20 k mais cinco milimolares de carbacol ou 20 k mais bário são mostrados para o canal mutante L 2 57 w.

Observe as correntes significativamente menores induzidas por álcool e carbo álcool. Esses achados sugerem que esse resíduo desempenha um papel importante no controle da abertura dos canais GK pelo álcool e pelas subunidades gama g e beta. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir uma mutação em um e iniciar, bem como estudar seu efeito na função do canal utilizando técnicas eletrofisiológicas avançadas.

Uma vez dominada, essa técnica de neogênese direcionada pode ser realizada em dois a três dias e ampliada para cinco ou mais mutações. O desenvolvimento dessas técnicas abriu caminho para que os biofísicos de canais iônicos explorem as propriedades básicas da função e do comportamento dos canais iônicos. Além disso, permitem aos pesquisadores estudar as doenças humanas causadas por uma única mutação em um gene de canal iônico.