Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Olá, eu sou Raja Ti, fazendo meu doutorado no Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Vou guiá-lo pelos passos envolvidos na ilustração 3D da modificação de Eastern que marcou o dano ao DNA e a condensação cromática em uma nova célula cardíaca. O DNA está enrolado ao redor das zonas nucleares.

Cada nucleossomo é composto por quatro tipos diferentes de histonas: H dois A, H dois B, H três e H quatro radi. A formação de quebras no DNA é marcada pelo PHO da H dois X. Esse PHO da H dois X ocorre principalmente em regiões cripticas que são marcadas pela metilação da H três K quatro. Agora, examinaremos a ilustração tridimensional das modificações em sua célula, imunomarcada com a camada PHO da H dois X e a H três K quatro metilada.

Vamos começar. Iniciamos colocando o curso E da suspensão celular em tubos Falcon de 15 ml. S são lavados duas vezes com PB centração a 150 G e Resus.

Suspenda em meio fresco para observar o efeito imediato da radiação sobre eventos celulares. Mantenha as células sob observação por cinco a dez minutos antes e durante a radiação. Exponha as células à radiação gama ou raios X. Após a radiação, distribua três mililitros da suspensão celular em cada GU de seis.

Placa de poços para pico de gama H2AX: incubar as células entre 30 minutos e uma hora a 37 graus centígrados. Utilizamos a citospin para depositar as células não aderentes em lâminas de vidro. Ao montar o suporte de citospin, certifique-se de que todo o disco de filtro coincida com o funil.

Dispense um volume de 50 microlitros, espalhe esta suspensão celular em cada posição final de citosina, coloque as lâminas de citosina na missão de citosina e centrifugue a 500 RPM durante cinco minutos. Remova as lâminas de citosina e separe as lâminas do cartão filtro. Não deixe as células secarem ao ar por muito tempo, pois isso pode influenciar o fundo na coloração com fluoresceína.

Usando um pino bloqueador de líquido, desenhe círculos ao redor de cada esfregaço; em seguida, fixe as células com paraformaldeído 4% à temperatura ambiente por cinco minutos. Em comparação com etanol ou ol, uma fixação melhor foi observada com paraformaldeído 4%. Incube as lâminas com células permeabilizadas com Triton X-100 à temperatura ambiente por cinco minutos.

Em comparação ao twin 80, observamos um sinal melhor nas células per com Triton X 100. Observe as células com PP S3 vezes cada uma por cinco minutos. Bloqueie as células em BSA por 10 minutos à temperatura ambiente e repita este procedimento três vezes quando comparado a outros agentes e tempos de bloqueio.

A BSA foi a mais eficiente na minimização da ligação não específica de anticorpos primários; utilizamos dois anticorpos primários diluídos na proporção de um para 500 com 1% de BSA, aplicando aproximadamente 50 microlitros de anticorpo primário em cada lâmina. A incubação do anticorpo primário à temperatura ambiente por 60 minutos reduz a coloração de fundo em comparação com a incubação durante a noite a quatro graus centígrados. Lave as células três vezes com PBS por cinco minutos.

Alexa floor 4 88, boa atividade anti-rato e Alexa floor 5 46 com atividade anti-coelho. Anticorpos secundários foram utilizados para detectar diferentes marcadores simultaneamente. Utilize anticorpos produzidos em espécies diferentes.

Adicione aproximadamente 50 microlitros do anticorpo secundário diluído a cada lâmina. Incube as células à temperatura ambiente por 90 minutos. Recomenda-se incubar as células em uma câmara úmida, pois isso evitará que as células e o anticorpo sequem; lave as lâminas com PBS 3 vezes, cada uma por cinco minutos.

Adicionaram-se 50 microlitros de uma diluição 1:500 de topo três em PBS a cada lâmina. Lave as lâminas com PBS três vezes, cada vez por cinco minutos. Remova o excesso de umidade das lâminas e adicione a solução Antifa.

Recomenda-se não secar completamente as células antes de adicionar a solução Antifa. Coloque uma lamínula sobre a lâmina. Deve-se ter cuidado para evitar a formação de bolhas de ar.

Deixe as lâminas durante a noite em uma câmara úmida e escura. Sobreponha a lâmina com esmalte para unhas para evitar a secagem das células. As imagens adquiridas em um microscópio confocal revelam.

Uma melhor resolução espacial foi obtida e um laser de hélio foi utilizado para a aquisição da imagem. Uma objetiva de imersão em óleo 63 foi preferida em vez de lentes com maior ou menor aumento. Um fator de zoom de três ou quatro produzirá uma imagem com melhor resolução.

Para a aquisição de imagens de muitas células, é preferível utilizar uma velocidade de varredura de oito e um tamanho de imagem de 1024 por 1024 pixels por célula. Ao realizar imagens com múltiplos canais, recomenda-se a aquisição por varredura sequencial de linhas em vez da varredura por quadros. Para evitar o desbotamento da amostra, o ganho do detector e o deslocamento do amplificador são ajustados para reduzir o ruído e a saturação do sinal.

Como o tamanho do Kama HX X quatro pode ser inferior a 0,5 micrômetros, recomenda-se adquirir imagens com resolução de pelo menos 0,5 micrômetro. É necessário obter imagens com passo ao longo do eixo do jato em um padrão de série de jatos, utilizando o padrão de marcar primeiro e marcar a perda. Para ilustrar a relação espacial entre diferentes proteínas, recomenda-se utilizar uma velocidade de varredura de seis com tamanho de imagem de 2048 e 248 pixels, usando o Metamor primeiro.

O segundo pode ser contado a partir de imagens adquiridas em diversos microscópios confocais. Abra as tags de imagem gamma hgx diretamente no menu de arquivos ou utilizando os números de identificação. Vá ao menu processar e escolha aritmética de pilhas.

Escolha a projeção máxima e selecione os planos a serem incluídos. Em seguida, clique em OK. Agora, escolha top hat e selecione a imagem Gamma H2X como imagem de origem para aplicar.

O filtro top hat e a imagem resultante serão uma imagem binária com menos ruído e variação reduzida na intensidade dos focos. Vá até regiões e selecione a ferramenta de desenho de regiões, desenhando regiões ao redor dos núcleos. Vá até processar, menu e aplique a imagem de limiar.

Escolha o limiar de inclusão e defina os valores dos limiares inferior e superior. Geralmente, são os valores de limiar que afetam os quatro números. O valor de limiar ideal é aquele que minimiza a inclusão do fundo e maximiza a inclusão da estrutura de interesse.

Isso pode ser melhor alcançado contando o número de forrageios utilizando diferentes valores de limiar. Em seguida, compare o número de forrageios com a contagem a olho nu. Selecione a imagem DPI e vá ao menu de regiões e escolha a opção transferir regiões.

Agora temos imagens correspondentes de hifas e núcleos prontas para contagem. A maioria das regiões nucleares é transferida para top hat. Vá ao menu Medir e selecione a análise integrada de áreas ou IMA, selecione Medir todas as regiões e clique em Medir para obter o número de FTE.

Agora, os números de FTE de cada região podem ser exportados para uma planilha utilizando a opção de dados de log. Abra as imagens do projetor de jato criadas anteriormente para cada canal. Vá até exibição e selecione alinhamento de cores.

Selecione as imagens de origem respectivas para cada canal para criar uma imagem para todos os três canais. A análise de varredura em linha é realizada para ilustrar o posicionamento espacial dos diferentes marcadores no núcleo. Acesse o comando das barras de ferramentas de medição e selecione a análise de varredura em linha, traçando uma linha seca através da célula.

Isso criará um gráfico mostrando a intensidade fluorescente de cada canal ao longo da linha e representará a distância entre diferentes marcadores em relação uns aos outros. Para criar uma imagem 3D a partir de uma pilha, vá ao menu pilha e escolha reconstrução 3D. Selecione o tipo de reconstrução 3D máximo.

Escolha o plano de rotação, escolha a distância de calibração do jato. Normalmente, o usuário especifica e clica em OK para criar uma reconstrução 3D. E isso conclui o nosso protocolo de imunofluorescência, coloração e análise de imagem.

Em resumo, o microscópio confocal de imunofluorescência é uma técnica para a visualização tridimensional de diferentes marcadores C e gama H dois X foy no núcleo celular. Obrigado por assistir.