Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Olá, sou Raja Ti fazendo meu doutorado no Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Vou guiá-lo pelas etapas envolvidas na ilustração 3D da modificação oriental que marcou danos ao DNA e condensação cromática em uma nova célula cardíaca. O DNA é enrolado em zonas nucleares.

Cada nucleossomo é composto de quatro tipos diferentes de histonas, H dois A, H dois b, H três e H quatro radios. A formação de quebras de DNA e isso é marcado por PHO de H dois X.Este pho de H dois X ocorre principalmente na creatina que é marcada pela metilação de H três K quatro. Agora veremos a ilustração 3D das modificações no imunomarcador celular com a camada pho H dois X e a metilada H Three K quatro.

Vamos começar. Começamos colocando o curso E da suspensão celular em 15 mil. Os tubos Falcon S são lavados duas vezes com aromatização PB em um 50 G e Resus.

Suspenda em novas mídias para ver o efeito imediato da radiação nos eventos celulares. Mantenha as células nos olhos por cinco a 10 minutos antes e durante a radiação. Exponha as células à radiação gama ou raios-x Após a radiação, dispense três mililitros da suspensão celular em cada GU de seis.

Placa de poço para pico gama H dois X incubar células entre 30 minutos a uma hora a 37 graus centígrados. Usamos a missão Cytosine para colocar as células não aderentes em lâminas de vidro. Ao montar o clipe de citosina, certifique-se de que todo o cabo do filtro coincida com o funil.

Dispense um 50 microlitros, limpe esta suspensão celular em cada citosina final, coloque os clipes de citosina na missão de citosina e gire-o 500 RPM por cinco minutos. Remova os clipes de citosina e separe as lâminas do cartão do filtro. Não deixe as células secarem ao ar por muito tempo, pois isso pode influenciar o fundo na coloração com fluoresceína.

Usando o pino de bloqueio de líquido, desenha círculos Ao redor de cada esfregaço, fixamos as células com cabeça de 4% de paraforma em temperatura ambiente por cinco minutos. Em comparação com etanol ou ol, uma melhor fixação foi observada com cabeça paraforme a 4%. Deslizamentos de vento com células permanentes PPS com Triton X 100 em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em comparação com o gêmeo 80, observamos um sinal melhor nas células com Triton X 100. Observe as células com PP S3 vezes cada por cinco minutos. Bloqueie as células em uma pessoa BSA por 10 minutos em temperatura ambiente e repita isso três vezes quando comparado a outros agentes bloqueadores e vezes.

A BSA foi mais eficiente Na minimização da ligação não específica de anticorpos primários, usamos dois anticorpos primários diluídos um em 500 com 1% de BSA em aproximadamente 50 microlitros de anticorpo primário para cada lâmina. A incubação do anticorpo primário à temperatura ambiente por 60 minutos reduz a coloração de fundo em comparação com a incubação noturna a quatro graus centígrados. Lave as células três vezes com PBS por cinco minutos.

Alexa andar 4 88, bom anti-mouse e Alexa andar 5 46 palavras anti coelho. Anticorpos secundários foram usados para manter diferentes marcadores simultaneamente. Use anticorpos criados em diferentes espécies.

Adicione aproximadamente 50 microlitros de anticorpo secundário diluído a cada lâmina. Incube as células em temperatura ambiente por 90 minutos. Recomenda-se incubar células em sua câmara úmida, pois isso impedirá que as células e os anticorpos sequem as lâminas de lavagem com PB S3 vezes cada por cinco minutos.

50 microlitros de uma diluição em 500 do topo três em PBS foram adicionados a cada lâmina. Lave as lâminas com PBS três vezes cada por cinco minutos. Remova o excesso de umidade das lâminas e adicione a solução Antifa.

Recomenda-se não secar completamente as células antes de adicionar a solução Antifa. Coloque uma lamínula na lâmina. K deve ser tomado para evitar a formação de bolhas de ar.

Deixe as lâminas durante a noite em uma câmara escura e úmida. Sele a lâmina com esmalte para evitar o ressecamento das células. As imagens adquiridas por um microscópio confocal revelam.

A melhor resolução espacial se foi e o laser de hélio foi usado para a aquisição da imagem. Um objeto de emissões de óleo 63 duas lentes preferidas a lentes de maior ou menor ampliação. Um fator de zoom de três ou quatro produzirá uma imagem de melhor resolução.

Para contabilidade de FO de muitas células, é preferível usar uma velocidade de varredura de oito, um tamanho de imagem de 1024 em células de 1024 pixels. Ao criar imagens para vários canais, recomenda-se uma aquisição de varredura de linha sequencial em comparação com a varredura de quadro. Para evitar o branqueamento da amostra, o ganho do detector e o deslocamento do amplificador são ajustados para reduzir os mouses e a saturação do sinal.

Como o tamanho do Kama HX X quatro pode ser inferior a 0,5 micrômetros, recomenda-se adquirir imagens com pelo menos 0,5 micrômetro. As imagens do tamanho do passo ao longo do eixo do jato são necessárias em um padrão de série de jato usando a marca primeiro e a marca perdida. Para ilustrar a relação espacial entre diferentes proteínas, recomenda-se usar uma velocidade de varredura de seis com tamanho de imagem de 2048 E 2 48 pixels usando metamor primeiro.

O segundo pode ser contado a partir de imagens adquiridas em vários microscópios confocais. Abra tags de imagem gamma hgx diretamente do menu de arquivo ou usando números de conta. Tags. Vá para o menu de processo e escolha Pilha aritmática.

Escolha a projeção máxima e selecione os planos a serem incluídos. E clique em OK. Agora escolha cartola e selecione Gamma H duas imagens X como imagem de origem aplicada.

O filtro de cartola e a imagem resultante serão uma imagem binária com menos ruído e variação reduzida na intensidade dos focos. Vá para regiões e selecione a ferramenta de desenho de região e desenhe regiões ao redor dos núcleos. Vá para processar, menu e imagem de limite de venda.

Escolha o limite de inclusão e defina os valores de limite inferior e superior. Geralmente, são os valores limite que afetam o número quatro. O valor limite ideal é aquele que minimiza a inclusão do plano de fundo e maximiza a inclusão da incursão.

Isso pode ser melhor alcançado contando o número de incursões usando diferentes valores limite. E então compare o número de incursão com a contagem a olho nu. Selecione a imagem DPI e vá para o menu de regiões e selecione a opção de transferência de regiões.

Agora temos incursões correspondentes e imagens nucleares prontas para contagem. A maioria das regiões nucleares é transferida para a cartola. Vá para o menu de medição e selecione análise integrada ou IMA, selecione Medir todas as regiões e clique em medir para obter o número FTE.

Agora, os números FTE de cada região podem ser exportados para a planilha usando a opção Dados de log. Abra as imagens do projetor a jato criadas anteriormente para cada canal. Vá para exibir e selecione alinhar cores.

Selecione as respectivas imagens de origem para cada canal para criar uma imagem de imagem para todos os três canais. A análise de varredura de linha é realizada para ilustrar o posicionamento espacial de diferentes marcadores no núcleo. Vá para o comando medir barras de ferramentas e selecione a linha seca da análise de varredura de linha na célula.

Isso criará um gráfico mostrando a intensidade fluorescente de cada canal ao longo da linha e representa a distância de diferentes marcadores em relação uns aos outros. Para criar uma imagem 3D a partir de uma pilha, vá para um menu de pilha e escolha Reconstrução 3D. Selecione o máximo do tipo de reconstrução 3D.

Escolha o plano de rotação, escolha a distância de calibração do jato. Normalmente, o usuário especifica clique em OK para criar uma reconstrução 3D. E isso conclui nosso protocolo para imunofluor e coloração e análise de imagem.

Em resumo, o microscópio confocal de imunofluorescência é duas técnicas para o visual tridimensional de diferentes marcadores C e gama H dois X foy no núcleo da célula. Obrigado por assistir.