Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

O objetivo geral deste procedimento é permitir uma configuração automatizada rápida e confiável de matrizes baseadas em QPCR. Isso é feito primeiro preparando os conjuntos de primers para a matriz e configurando as misturas master de amostra a serem filtradas. Em seguida, uma configuração automatizada de PCR robótica ou um sistema de pipeta eletrônica de matriz é usado para definir com precisão a mistura mestre de amostras Eloqua e os conjuntos de primer em cada poço de uma placa de 384 poços.

Uma vez preparadas, as reações de PCR de 384 poços são executadas com o programa de PCR baseado em cyber do ciclador de luz quatro 80. A etapa final do procedimento é analisar os dados de QPCR e determinar os níveis de expressão relativos para cada par de primers testado, cada um dos quais tem como alvo um mRNA específico. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças na expressão de grandes conjuntos de mRNAs.

Matrizes especificamente desenvolvidas podem, portanto, ter como alvo perfis inteiros de pré-micro RNA, vias específicas ou moléculas essenciais para a infecção viral por meio de perfis baseados em QPCR. Olá, sou Dirk DMA do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. Hoje mostraremos como configurar o QQPC rra em tempo real e mostraremos dois métodos.

Um, usando pipeta irregular e outro usando um robô. Usamos essa tecnologia para medir pré-microRNAs e microRNAs maduros em tumores humanos. A demonstração de hoje será feita por Pauline Chu e Kristen bu.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, recupere as placas de primer contendo 186 pares de primers em um 96. Formato de poço a 0,5 picaMoles armazenados a menos 20 graus Celsius.

Depois de descongelar as placas à temperatura ambiente, faça um vórtice e centrifugue-as brevemente. Descongele também o verde cibernético duas vezes a mistura de PCR à temperatura ambiente para a configuração de cada placa de primer de 96 poços, quatro tubos de mistura mestre serão necessários. Prepare a mistura principal combinando quatro microlitros de mistura verde cibernética, três microlitros de água grau PCR e 10 a 20 nanogramas de amostra de DNA ou CDNA por reação em cada um dos quatro tubos einor de dois mililitros.

Cada tubo deve conter mistura principal suficiente para aproximadamente 100 reações, permitindo o excesso de resíduos de pipetagem. Vortex os tubos einor para misturar. Comece a configuração do ensaio de micro RNA precursor usando o robô Tecan EVO freedom com inicialização do robô e carregamento do programa de desgaste EVO.

Em seguida, lave o robô três vezes com 30 mililitros de líquido do sistema para limpar o sistema de bolhas de ar que interferirão na precisão da pipetagem. Em seguida, configure a plataforma do robô para incluir uma placa de 384 poços e uma placa de primer de 96 poços. O mestre mistura uma calha contendo 2% de alvejante, um sistema cheio, um recipiente de fluido e um recipiente de lixo vazio.

Inicie a execução automatizada do robô selecionando executar duas vezes no final do programa. Remova a placa de 384 poços e sele com a folha de teto do ciclador de luz quatro 80. Em seguida, centrifugue a placa.

Coloque brevemente a placa de 384 poços selada na posição um do hotel. Em seguida, repita esse processo para a placa de primer dois com novas misturas principais e uma nova placa de 384 poços. Coloque a placa do mundo 384 selada resultante na posição dois do hotel.

Abra um novo programa de desgaste EVO para carregar o ciclador de luz do hotel e defina os parâmetros de ciclismo. Em seguida, selecione executar duas vezes. O Freedom Evo carregará automaticamente cada placa no ciclador de luz e executará o programa de ciclismo HRM verde cibernético.

Depois de concluído. Revise e analise os resultados conforme descrito no protocolo escrito como uma alternativa ao uso do robô. Uma pipeta multicanal eletrônica de matriz pode ser usada para começar a colocar o conteúdo do tubo de mistura principal em um reservatório.

Defina a pipeta eletrônica para aspirar 16 microlitros de master mix com duas etapas de dispensação de oito microlitros seguidas por uma etapa de purga. Depois de definir a pipeta, aspire 16 microlitros de master mix e comece a dispensar em uma placa de roda 384. Distribua os primeiros oito microlitros em todas as outras linhas da coluna um usando as linhas A a O, deixando a próxima coluna vazia.

Distribua os segundos oito microlitros nas mesmas linhas da coluna três. Em seguida, limpe sobre um recipiente de lixo e descarte as pontas seguindo este padrão de deixar linhas e colunas alternadas. Dispense na placa por mais cinco ciclos para pipetar a mistura principal dois.

Utilize as mesmas linhas do master mix um, mas comece com a coluna dois. Repita este procedimento para as misturas principais três e quatro, começando com as colunas um e dois, respectivamente, mas desta vez usando a rosa B a P.Her citando a placa de primer. Defina uma pipeta eletrônica para aspirar dois microlitros e dispensar dois microlitros com uma etapa de purga a seguir.

Transfira dois microlitros de primers da coluna uma linha A para H de uma placa de primer de 96 poços para todas as outras colunas de remo uma das 384 placas de poços purga sobre um recipiente de lixo e descarte as pontas. Repita este padrão para o primer quatt para as três misturas principais restantes das colunas um e dois. Em seguida, continue este processo para as colunas dois a 12 da placa de primer de 96 poços, movendo-se sobre cada duas colunas na placa de 384 poços para cada coluna de primer.

Em seguida, sele as placas com um teto de ciclador leve, papel alumínio e centrífuga. Brevemente após a centrifugação. Coloque as placas em um ciclador leve quatro 80 e cicle as placas usando o formato de detecção HRM verde cibernético.

Usando as mesmas condições de ciclagem de antes, repita este procedimento usando a placa de primer dois Eloqua em uma placa nova de 384 poços usando misturas master recém-preparadas. As assinaturas de micro RNA precursor emergem por meio de perfis usando uma nova matriz baseada em QPCR. O delta CT médio normalizado para U seis foi calculado e os valores padronizados foram carregados na matriz.

Software secundário produzindo três clusters distintos exibidos como mapas de calor. A expressão relativa de cada micro RNA precursor é mostrada em vermelho e azul representam um aumento e diminuição na expressão relativa, respectivamente. A intensidade da cor indica o grau de mudança de expressão.

A maioria dos microRNAs precursores sofreu pequenas alterações insignificantes conforme o esperado. No entanto, uma pequena porção de microRNAs precursores aumentou significativamente ao longo do experimento de curso de tempo. Além disso, o nível relativo de alguns microRNAs precursores diminuiu drasticamente.

Em alguns casos. Eles também se agrupam na análise do mapa de calor. Dependendo do experimento, podem surgir clusters dependentes de infecção viral, expressão específica do tipo de célula de microRNAs precursores ou microRNAs precursores que são regulados por uma molécula comum ou via de sinalização.

Os limiares médios do ciclo ou cts de uma amostra negativa do vírus do herpes associado ao sarcoma de Posey executando duplicata quádrupla são mostrados. É importante ressaltar que o antígeno nuclear associado à latência do vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi ou KSHV Lana não foi detectado nesta amostra pela matriz QPCR altamente sensível. No entanto, tanto o controle interno U seis quanto o let seven a um micro RNA precursor humano altamente expresso, foram expressos em níveis detectáveis.

Finalmente, como esperado, o controle negativo da água de grau PCR não produziu o produto A-Q-P-C-R. Uma análise da curva de fusão para dois primers diferentes. Usando a mesma duplicata de amostragem é mostrada.

É claro que a temperatura de fusão é diferente para os dois pares de primers, mas a amostra está derretendo exatamente na mesma temperatura para cada replicação. Os sinais de uma amostra ruim ou potencialmente contaminada podem incluir vários picos de fusão, sugerindo a presença de duas fontes diferentes de entrada. Acabamos de mostrar como configurar experimentos de QPCR em tempo real usando um robô.

É importante que você inclua todos os controles e o maior número possível de genes de limpeza. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.