Name: Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de transecção do nervo óptico em ratos para estudar apoptose em neurônios do sistema nervoso central adulto. Este modelo reprodutível permite investigar morte celular e estratégias neuroprotetoras.

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1. Técnica Cirúrgica <ol><li> Experimentos devem ser realizados com técnica asséptica e seguindo os protocolos de uso de animais de sua instituição específica. Instrumentos e materiais (soluções, as substâncias, marcadores, agulhas, etc) entrem em contacto com tecidos vivos, deve ser esterilizado para evitar infecções e impactos negativos no bem-estar animal e os potenciais impactos negativos sobre o estudo. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Ratos serão anestesiados utilizando um sistema vaporizador veterinária isoflurano. Uso de oxigênio classe médica a uma taxa de 0,8 L / min para vaporizar o gás isoflurano. Colocar o animal na caixa de anestesia em anexo e marcar em uma concentração de isoflurano de 4%, até a respiração desacelerou e se o animal está tranqüilo. </li><li> Em seguida, mudar o fluxo de gás para o anexo máscara de gás para o quadro estereotáxico e colocar o animal no aparelho estereotáxico. Por sua vez a concentração de isoflurano para 2% e monitorar anestesia. Animais de maior porte (&gt; 300g) pode exigir uma maior concentração de isoflurano. A anestesia deve ser monitorizada durante a cirurgia e dosagem isoflurano ajustado em conformidade. Profundidade e taxa de respiração deve ser constantemente avaliados e avaliação toe pitada (a cada 5 minutos) para a ausência de dor profunda deve ser realizada. </li><li> Uma vez que a cirurgia está completa, desligue o isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos antes da remoção do dispositivo estereotáxico. Temperatura corporal deve ser mantida, cobrindo o animal com um cobertor cirúrgica e / ou usar um cobertor de aquecimento regulados durante a cirurgia. </li></ol> 3. Abordagem cirúrgica <ol><li> Molhar o pêlo no alto da cabeça com etanol 70% para tornar a pele mais fácil de cortar. Retire a pele de entre os olhos usando um cortador ou tesoura afiada. Limpar a área da incisão três vezes, com aplicações alternadas de solução de detergente de iodo (Betadine Proviodine, etc), seguido pelo etanol 70%. Manter a córnea úmida durante toda a cirurgia através da aplicação de pomada oftálmica nos olhos (lágrimas Naturale PM) para a córnea. Espalhar a pomada sobre a superfície da córnea por manualmente abrindo e fechando as pálpebras. </li><li> Usando uma lâmina n º 11, fazer uma incisão ao longo da linha média da cabeça de aproximadamente 0,5 cm à frente dos olhos a 1 cm atrás dos olhos. Recolher o flap de pele sobre o olho com a pinça e gentilmente provocar afastado o tecido conjuntivo subjacente com a parte de trás do bisturi. Então, recolher o flap de pele lateralmente e para baixo e segure no lugar com um retrator cirúrgico que pode ser colado na base do aparelho estereotáxico. </li><li> Faça uma incisão ao longo da borda superior do osso orbital, enquanto puxando a fáscia que cobre com uma pinça afiada. Isso vai retirar a fáscia que recobre a órbita do olho. A borda do osso orbital pode ser claramente demarcada usando uma pinça para empurrar para baixo sobre a fáscia que recobre a órbita. Usando um cautério ou bisturi, continue a incisão para trás para o limite posterior da órbita do olho. Use o osso da órbita superior como um guia para a incisão. Em seguida continue a frente da incisão para o limite anterior da órbita. A incisão da órbita superior é o melhor feito usando um cautério pequenos, a fim de evitar sangramento dos vasos subjacentes que se comunicam com os seios venosos. </li><li> Se o sangramento ocorre várias etapas podem ser tomadas. Em primeiro lugar, aplicar pressão usando swabs estéreis cirúrgica ou cotonetes. Se o sangramento continua, aplicar frio, solução salina tampão estéril de fosfato (PBS) para a área usando um conta-gotas, e manter a pressão. Sangramento menor vai parar depois de alguns segundos usando este procedimento. Se o sangramento persistir, aplique a tração para o tecido com o cotonete cirúrgico ou cotonete, a fim de identificar a origem da hemorragia e rapidamente cauterizar o vaso comprometido. Depois que o sangramento é contido, use frio PBS esterilizado para limpar a área cirúrgica do sangue. A área cirúrgica devem ser periodicamente limpos desta forma, a fim de visualizar melhor as estruturas na órbita do olho. </li><li> Uma vez que a incisão tenha sido limpo, utilize uma pinça e parte de trás do bisturi para limpar o tecido conjuntivo na parte de trás do olho que recobre o conteúdo orbital. Parte de trás do bisturi n º 11 funciona bem como a ponta é fina. Isto irá abrir porções mais profundas da cavidade orbital proporcionando uma maior janela cirúrgica para trabalhar dentro Use Dumont 7b # sharp-curvo-serrilhada forceps durante o trabalho no olho como a sua curvatura e dicas finas são ideais para a manipulação de estruturas em órbita. Além disso, o serrilhas ajudar com estruturas de fixação. </li><li> Em seguida, retire o tecido conjuntivo que envolve a divisão oftálmica do nervo trigêmeo, que fica perto da linha média, e remover o nervo usando uma pinça. Este passo não é necessário, no entanto remover o nervo irá proporcionar uma maior janela de access para o nervo óptico mais tarde. </li><li> Após a remoção do nervo, utilize uma pinça para retirar o vaso sanguíneo abaixo e completamente cauterizar o vaso. Esta etapa também não é necessário, no entanto cautério da embarcação permite que ele seja transferido anteriormente, criando assim uma janela maior uma vez que o nervo óptico é atingido. </li><li> Use um par de pinças afiadas, ou fórceps que tiveram suas pontas dobradas para dentro, para escolher com cuidado e retire a fina camada de tecido conjuntivo ao longo dos músculos extra-oculares e glândula lacrimal. Retrair os músculos oculares extra a partir de anterior para posterior da órbita. Segure a parte proximal do músculo com uma pinça e usar um segundo par de pinças curvas serrilhadas vestir olho para aplicar tração externa sobre o músculo. Certifique-se que a pinça de vestir os olhos são orientadas na mesma direção como o músculo ao puxar para evitar rasgamento. Retire o músculo mais anterior da órbita (Superior Oblique) dessa maneira. O músculo será liberado de dentro da órbita eo comprimento restante pode ser retraído, a fim de girar o olho para fora. </li><li> Repita o Passo 3,8 com o músculo seguinte (reto medial) que está localizado entre os lobos da glândula lacrimal e Gland Harderian perto da linha média da superfície dorsal do olho. Tape as retrator para manter a tração sobre os músculos. </li><li> Remova com cuidado o tecido remanescente conjuntivo sobre a superfície da glândula lacrimal e levante a glândula para cima usando uma pinça. Não comprimir ou apertar as glândulas. , A fim de retirar a glândula, apenas um único navio no pólo posterior precisa ser cauterizado. Levante a extremidade posterior da glândula para cima, e depois cauterizar o vaso. </li><li> Em seguida, flap da glândula lacrimal para a frente para abrir a parte posterior da órbita e permitir livre acesso para os músculos que recobrem o nervo óptico. Manter a área sempre úmida usando PBS estéril e secagem com compressas cirúrgicas ou cotonetes. </li><li> Utilizando uma pinça afiada, mais uma vez remover o tecido fino conectivo que envolve os músculos da órbita posterior (levantador da pálpebra superior e reto superior) e separar os feixes de músculos subjacentes. Retrair os músculos de forma independente ou em conjunto, utilizando a curva serrilhada forceps vestir olho, mais uma vez, puxando em linha com as fibras musculares. Anexar os comprimentos musculares restantes para o afastador juntamente com os músculos que foram recolhidos nas Etapas 3.8 e 3.9 e fita para baixo o retrator para aplicar tração. Um total de 4 músculos agora será anexado ao retrator. Isso irá girar o olho para a frente e para fora, a fim de revelar a capa de gordura que contêm que envolve o nervo óptico. </li></ol> 4. Acessando o Nervo Óptico <ol><li> Use uma pinça afiada (Fine ponta Dumont) para puxar para cima sobre o tecido conjuntivo que envolve a bainha de gordura do nervo óptico. Faça um corte longitudinal com uma tesoura pequena mola Vannas. Expandir o corte como necessário. A gordura contida pela bainha começará a protuberância para fora uma vez que o corte é feito. Em seguida retire os retalhos de tecido conjuntivo com cuidado puxando para cima a partir da borda e cortar as abas em forma de crescente de tecido. </li><li> Remova a gordura que cobre o nervo óptico, usando uma pinça para puxar a gordura, enquanto o corte com a tesoura primavera Vannas. Manter a área limpa usando PBS esterilizado e compressas cirúrgicas para limpar a pequenas quantidades de sangue que surgem a partir da remoção do tecido. </li><li> O nervo óptico é agora visível. Para acessar o nervo, a bainha meníngea que envolve o nervo deve ser removido sem danificar a artéria oftálmica que alimenta a retina interna. Examine o padrão vascular da bainha meníngea usando uma pinça para girar suavemente a bainha. Procure uma área desprovida de vasos sanguíneos, e permitindo um corte longitudinal a ser feita na bainha meníngea. </li><li> Usando a ponta fina Dumont fórceps, beliscar a dura e puxar para cima. Perto da base da cunha triangular em forma de dura que é criado, use a tesoura primavera Vannas para fazer uma pequena incisão na bainha. Insira o menor lâmina da tesoura na incisão e cortar a bainha paralela à direção do nervo óptico, cuidado para não danificar os vasos com cortes laterais. Use a pinça e tesouras para armar a dura para ambos os lados do nervo óptico. </li><li> O revestimento único remanescente do nervo é a membrana aracnóide. É muito fina e transparente. A fim de determinar se a membrana está ainda presente, utilize uma pinça afiada para beliscar a superfície do nervo. É a aracnóide está presente, apertar a membrana e puxe para cima para criar uma cunha triangular de tecido. Fazer uma pequena incisão com a ponta da tesoura semelhante ao Passo 4.4. Em seguida, insira a parte inferior da lâmina da tesoura e fazer um corte longitudinal na aracnóide. Em seguida, use a sua tesoura e uma pinça para armar a aracnóide para ambos os lados do nervo óptico. </li><li> Usando um micro-surgancho tecnológico, elevar o nervo óptico para fora da bainha meníngea. Passe a ponta do anzol em torno da borda externa do nervo e certifique-se que o gancho fica em contato com o nervo, para que você não pegar as membranas das meninges com o gancho e acidentalmente transecto-los. Levante cuidadosamente o nervo óptico para fora da bainha meníngea e completamente transecto o nervo atrás do ponto apoiado pelo gancho. O coto do nervo óptico transeccionados terá agora uma extremidade livre, permitindo a remoção do gancho. </li><li> Se o RGCs vão ser retrogradamente marcados, a fim de quantificar a sobrevivência, coloque um pequeno pedaço de gelfoam embebido em Fluorogold 3% (ou outra tracer retrógrada) sobre o coto do nervo seccionado óptica (ver <a href="https://www.jove.com/details.php?id=2261">JOVE protocolo de 2261</a> ). </li></ol> 5. Fechamento e recuperação <ol><li> Aliviar a tração sobre os músculos oculares extras e voltar os olhos para uma posição neutra. Ao fazê-lo, certifique-se para empurrar o gelfoam para dentro da órbita do olho para garantir que a vista é girada de volta no lugar, o gelfoam permanece em torno do coto do nervo óptico. Retorno da glândula lacrimal e músculos oculares extra para suas posições naturais. </li><li> Devolver o retalho de pele para a linha média e sutura do ferimento. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos. Então, desligue a fonte de isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos. Colocar o animal em uma gaiola aquecida ou uma gaiola debaixo de uma lâmpada de calor para se recuperar. Não coloque nenhum fundamento na gaiola de recuperação para eliminar a possibilidade de aspiração da cama durante a recuperação. </li><li> Animais devem ser alojados de forma independente após a cirurgia. Pós-cirúrgica analgésicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de sua autoridades cuidados com os animais e os animais devem ser cuidadosamente monitorizados após a cirurgia. </li></ol> 6. Resultados representativos: Transecção do nervo óptico resultados na perda de 90% dos RGCs feridos dentro de 14 dias postaxotomy 9-11. O principal mecanismo da morte RGC é apoptose 9, 12. A densidade normal de RGCs é de aproximadamente 2.500 células / mm 2. Imagens de epifluorescência ou confocal pode ser usado para visualizar RGCs retrogradamente marcados após axotomia. Apoptose RGC é adiada por aproximadamente 4 dias após axotomia, deixando uma janela de tempo para manipulações experimentais. Menos 1 dia após a axotomia e rotulagem retrógrada com Fluorogold, corpos celulares RGC na camada de células ganglionares da retina e fascículos axônio na camada de fibras nervosas da retina são claramente visíveis quando a imagem de um preparo flatmounted (Fig 1a). Por 14 dias após a axotomia, a maioria dos RGCs morreram, e um RGCs poucos remanescentes são intercaladas entre microglia da retina (Fig 1b). Quando RGCs sofrem apoptose, microglia fagocitam as células mortas e, como resultado tornar transcellularly rotulado com o marcador fluorescente que era usado para rotular a RGCs 13, 14. A aparência do marcador no fagossomos de microglia é diferente daquela em RGCs sobreviventes. Microglia conter o marcador nos fagossomos altamente concentrada e extremamente luminosos, que são relativamente grandes e espalhados por todo o seu citoplasma (Fig. 1c). RGCs têm um padrão mais difuso de coloração (Fig. 1c) com pequenas vesículas puntiformes que foram transportados retrogradamente para baixo seus axônios apresentação do citoplasma da célula. Essas vesículas são muito menores e têm menos intensa fluorescência permitindo que se possa diferenciar RGCs sobrevivente da microglia. Além disso, microglia têm corpos celulares muito menores e tendem a ter uma morfologia estreladas ou amoeboid ao contrário RGCs que têm corpos celulares relativamente grandes e arredondadas. As árvores dendríticas de RGCs também pode ajudar a diferenciá-los dos processos curto brilhante da microglia, ao quantificar a sobrevivência da célula. Sobrevivência da célula podem ser quantificados em diferentes regiões da retina e da densidade (células / mm 2) podem ser extrapolados a partir da área do micrografias correspondentes, desde RGCs são encontrados em uma monocamada dentro da camada de células ganglionares. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Micrografias de epifluorescência de Fluorogold RGCs rotulados após axotomia e aplicação do traçador ao coto do nervo óptico. (A) um dia após axotomia RGCs fascículos e seu axônio são rotulados com o marcador de uma forma bem pontuada. (B) Por 14 dias após a axotomia, 90% dos RGCs morreram e brilhantemente rotulados microglia que fagocitados células mortas também são rotulados com o marcador. (C) Maior aumento ilustrando a diferença entre RGCs e microglia (setas vermelhas) em 14 postaxotomy dias. Barra de escala em A e B é 50 mm. Barra de escala em C é 25 mm.

<ol><li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li>
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<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Há muitas variações deste procedimento cirúrgico e vários dos passos neste protocolo não são necessárias. Só é necessário para retrair os músculos que recobrem o nervo óptico, a fim de ganhar acesso ao nervo. No entanto, isso resulta em um espaço muito limitado trabalhando ao redor do nervo fazendo os estágios críticos final da transecção mais difícil. Em certas situações é desejável transfecção as células do tronco do nervo óptico e do espaço maior acesso proporcionada pela retração de todos os músculos extra-oculares ...

<table><tbody><tr><td>Quadro Estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máscara de Gás para Ratos</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Anestesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Cirúrgico</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold -(Hidroxiestilbamidina bis(metanosulfonato))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proviodine</td><td>Medline Industries</td><td>MDS093945H</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de mola de Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta fina de Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Gancho microcirúrgico</td><td>Fine Science Tools</td><td>10062-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça serrilhada para curativo ocular</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta curva serrilhada fina nº 7b Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizador</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr></tbody></table>

transecção do nervo óptico: um modelo de apoptose neuron adultos no sistema nervoso central

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto 1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas através da aplicação de curto RNAs de interferência (siRNAs), plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico vetores 5-7 ou injetar seu alvo, o colículo superior 8. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal desejado sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. Um benefício adicional é a facilidade e precisão com que a sobrevivência da célula podem ser quantificados após a lesão. A retina é um tecido, liso em camadas e RGCs estão localizadas na camada mais interna, a camada de células ganglionares. A sobrevivência da RGCs pode ser rastreado ao longo do tempo através da aplicação de um marcador fluorescente (3% Fluorogold) até o fim do corte do nervo óptico no momento da axotomia, ou pela injeção de traçador no colículo superior (alvo RGC) uma semana antes axotomia. O marcador é transportado retrogradamente, rotulagem toda a população RGC. Porque a camada de células ganglionares é uma monocamada (uma célula de espessura), as densidades RGC podem ser quantificados em tecido liso-montada, sem a necessidade de estereologia. Transecção do nervo óptico leva à morte apoptótica de 90% da RGCs feridos dentro de 14 dias postaxotomy 9-11. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela de tempo para manipulações experimentais contra vias envolvidas na apoptose.

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Noventa por cento das células ganglionares da retina (RGCs) cujos axônios são completamente seccionado (axotomia) morrem dentro de 14 dias após a axotomia. Esse modelo se adequa facilmente a manipulações experimentais e altamente reprodutível.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

As células ganglionares da retina (CGRs) são neurônios do SNC que transmitem informações visuais da retina para o cérebro, por meio do nervo óptico.
O nervo óptico pode ser...

As células ganglionares da retina ou Células RG são neurônios do sistema nervoso central que transmitem informações visuais da retina para o cérebro através do nervo óptico. A transecção é um modelo reprodutível de morte celular neuronal apoptótica no sistema nervoso central adulto. Aqui, a transecção do nervo óptico é realizada mediante abertura da órbita superior do olho, obtendo-se acesso às estruturas que recobrem o nervo óptico.A glândula lacrimal e os músculos extraoculares são retratados e as camadas meníngeas que revestem o nervo óptico são abertas. Em seguida, o nervo óptico é levantado das camadas meníngeas e cortado. Em última análise, 90% das células ganglionares da retina lesionadas, cujos axônios compõem o nervo óptico, morrem por morte celular programada dentro de duas semanas após a lesão.A principal vantagem dessa técnica em relação a outros modelos de lesão cerebral é que a transecção do nervo óptico é mais reprodutível e os neurônios lesados podem ser alvo de manipulações experimentais com maior facilidade. As implicações dessa técnica estendem-se às terapias para lesões e doenças do sistema nervoso central, pois a retina neuro-sensorial faz parte do sistema nervoso central adulto. A demonstração deste procedimento será realizada por Philippe Donofrio e Mark Magus para estudantes de pós-graduação do meu laboratório.Inicie este procedimento colocando uma rata na câmara de anestesia e ajustando uma concentração de isoflurano de 4%. Uma vez que a respiração do animal tenha diminuído, mude o fluxo de gás para o acessório de máscara facial do estereotáxico e posicione o animal no aparelho estereotáxico. Em seguida, reduza a concentração de isoflurano para 2%. Coloque o cone nasal e monitore a anestesia. Umedeça os pelos na parte superior da cabeça com etanol 70% para facilitar o corte dos pelos.Em seguida, utilizando tesouras, remova o pêlo entre os olhos com compressas estéreis de gaze de algodão. Limpe a área da incisão com três aplicações alternadas de Betadine, seguidas por etanol 70%. A seguir, aplique pomada oftálmica na córnea para evitar que ela seque durante a cirurgia e espalhe a pomada pela superfície abrindo e fechando as pálpebras.Usando uma lâmina número 11, faça uma incisão ao longo da linha média da cabeça, de aproximadamente 0,5 centímetros à frente dos olhos até um centímetro atrás dos olhos. Com o auxílio de uma pinça, retraiam-se a aba de pele sobre o olho. Utilize o dorso do bisturi para separar suavemente o tecido conjuntivo subjacente e soltar a pele sobrejacente.Em seguida, retrair lateralmente e para baixo a aba de pele e mantê-la no lugar com um afastador cirúrgico. Fixar o afastador com fita adesiva à base do instrumento estereotáxico enquanto se puxa a fáscia sobrejacente com pinça fina, fazendo uma incisão ao longo da borda superior do osso orbital. Isso fará com que a fáscia sobrejacente à órbita do olho seja afastada.Use uma pin&ccedil;a para pressionar a f&aacute;scia que recobre a &oacute;rbita e, com um pequeno dispositivo de cauteriza&ccedil;&atilde;o, delimite claramente a borda do osso orbital. O uso do dispositivo de cauteriza&ccedil;&atilde;o evitar&aacute; sangramento dos vasos subjacentes que se comunicam com os seios venosos. Use PBS frio e est&eacute;ril para limpar a &aacute;rea cir&uacute;rgica de qualquer sangue.A área cirúrgica deve ser limpa periodicamente dessa forma para permitir uma melhor visualização das estruturas na órbita do olho. Uma vez que a incisão tenha sido limpa, use pinça e a parte traseira do bisturi para remover o tecido conjuntivo na parte posterior do olho que recobre o conteúdo orbital. Isso abrirá a cavidade orbital, proporcionando uma janela cirúrgica maior para o trabalho.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as serrilhadas curvas finas n&uacute;mero sete B Dumont, remova o tecido conjuntivo que envolve a divis&atilde;o oft&aacute;lmica do nervo trig&ecirc;meo, que se situa pr&oacute;ximo &agrave; linha m&eacute;dia, e remova o nervo utilizando as pin&ccedil;as. Embora esta etapa n&atilde;o seja necess&aacute;ria, a remo&ccedil;&atilde;o do nervo proporcionar&aacute; uma janela de acesso maior ao nervo &oacute;ptico posteriormente, ap&oacute;s a remo&ccedil;&atilde;o do nervo. Utilize as pin&ccedil;as para retrair o vaso sangu&iacute;neo abaixo e cauterize completamente o vaso.Este passo também não é necessário, contudo, a cauterização do vaso permite que ele seja movido anteriormente, criando assim uma janela maior. Ao atingir o nervo óptico, utilize um par de pinças cuja ponta tenha sido curvada para dentro, para cuidadosamente levantar e remover a fina camada de tecido conjuntivo sobre os músculos extraoculares e a glândula lacrimal.Retraia os músculos extraoculares do ântero-posterior da órbita. Segure a parte proximal do músculo com um par de pinças e use um segundo par de pinças curvas serrilhadas para curativos oculares, orientadas na mesma direção do músculo, para aplicar tração para fora. Remova o músculo mais anterior da órbita, o oblíquo superior.Novamente, utilizando a mesma técnica, remova o reto medial localizado entre os lobos da glândula lacrimal e a glândula dura próxima à linha média da superfície dorsal do olho. Usando pinça, remova suavemente qualquer tecido conjuntivo remanescente sobre a superfície da glândula lacrimal e levante a glândula para cima. Não comprima nem aperte a glândula para retrair a glândula.Levante a extremidade posterior da glândula para cima e, em seguida, cauterize o vaso no polo posterior. Em seguida, puxe a glândula lacrimal para frente para abrir a parte posterior da órbita, permitindo acesso desimpedido aos músculos que recobrem o nervo óptico. Novamente, aplique PBS estéril para manter a área úmida e remova qualquer sangue com swabs cirúrgicos utilizando pinças finas.Mais uma vez, remova o tecido conjuntivo fino que envolve os músculos da órbita posterior e separe os feixes musculares subjacentes utilizando a pinça curva serrilhada para curativos oculares. Puxe na direção das fibras musculares para retrair os músculos separadamente ou em conjunto. Por fim, fixe a lente muscular remanescente ao retrator juntamente com os músculos retratados e prenda o retrator com fita adesiva para aplicar tração.Isso fará com que o olho gire para frente e para fora, a fim de revelar a bainha contendo gordura que envolve o nervo óptico. Usando uma pinça fina Dumont, puxe para cima o tecido conjuntivo que cobre a bainha gordurosa do nervo óptico, utilizando uma tesoura de mola venosa pequena. Faça um corte longitudinal.Amplie o corte conforme necessário. A gordura contida na bainha começará a salientar-se. Em seguida, puxe cuidadosamente para cima a partir da borda e corte as abas de tecido em forma de crescente usando pinças para puxar a gordura.Corte a gordura que recobre o nervo óptico com a tesoura cirúrgica de mola de Veneza. Com PBS estéril e cotonetes cirúrgicos, limpe as pequenas quantidades de sangue que surgem com a remoção do tecido. O nervo óptico está agora visível para acesso ao nervo óptico.A bainha meníngea que envolve o nervo deve ser removida sem danificar a artéria oftálmica, que irriga a retina interna. Usando pinças para girá-la suavemente, examine o padrão vascular da bainha meníngea com pinças finas do tipo Dumont. Aperte a dura-máter e puxe para cima, criando um cunha em formato triangular próxima à base do nervo.Use a tesoura para fazer uma pequena incisão longitudinal na bainha meníngea, tomando cuidado para não danificar a vasculatura. Insira a lâmina inferior da tesoura na incisão e corte a bainha paralelamente à direção do nervo óptico.Use a pinça e a tesoura para afastar a dura para os lados do nervo óptico. A única cobertura remanescente do nervo é a fina e transparente membrana aracnoideia. Para determinar se a membrana ainda está presente, use uma pinça fina para pinçar a superfície do nervo e puxar para longe da superfície. Se as coberturas meníngeas ainda estiverem presentes, serão visíveis.Se a aracnoide estiver presente, pinça a membrana e puxe para cima. Para criar uma cunha triangular de tecido, faça uma pequena incisão com a ponta da tesoura. Em seguida, insira a lâmina inferior da tesoura e faça um corte longitudinal na aracnoide.Em seguida, use tesoura e pin&ccedil;a para afastar as aracnoides para os lados do nervo &oacute;ptico. Utilizando um gancho microcir&uacute;rgico, eleve o nervo &oacute;ptico para fora da bainha meningeal. Passe a ponta do gancho ao redor da borda externa do nervo e certifique-se de que o gancho permane&ccedil;a em contato com o nervo.Evite prender as membranas meníngeas com o gancho e cortá-las acidentalmente. Levante suavemente o nervo óptico da bainha meníngea e seccione completamente o nervo atrás do ponto sustentado pelo gancho. O coto do nervo óptico seccionado terá agora uma extremidade livre.Remova o gancho se os Cs RG forem ser marcados por retrotransporte. Para quantificar a sobrevivência, coloque um pequeno pedaço de espuma de gel embebido em fluoro dourado 3% ou outro marcador retrógrado sobre o coto do nervo óptico seccionado. Alivie a tração sobre os músculos extraoculares e empurre a superfície ocular superior em direção à linha média para retornar o olho a uma posição neutra.Ao mesmo tempo, empurre o gelatina para dentro da órbita do olho. Isso garante que o olho seja girado de volta para a posição correta e que a espuma de gel permaneça ao redor do coto do nervo óptico. Retorne a glândula lacrimal e os músculos extraoculares para suas posições naturais, reposicione o retalho de pele para a linha média e sutura a ferida.Aplicar pomada oftálmica nos dois olhos. Após a cirurgia ser concluída, desligar o isoflurano e permitir que o animal respire oxigênio por vários minutos. Remover o animal do aparelho estereotáxico.Coloque o animal em uma gaiola sob uma lâmpada de aquecimento para se recuperar, a fim de eliminar a possibilidade de o rato aspirar o forramento durante a recuperação. Certifique-se de que não haja forramento na gaiola de recuperação. Administre analgésicos pós-cirúrgicos.De acordo com as diretrizes institucionais, monitore cuidadosamente o animal após a cirurgia. A secção do nervo óptico resulta na perda de 90% das CRR lesionadas dentro de 14 dias após a secção. O mecanismo principal da morte das CRR é a apoptose.A densidade normal de CNGs é de aproximadamente 2.500 células por milímetro quadrado. A imagem por epifluorescência ou confocal pode ser utilizada para visualizar CNGs marcados por retrotransporte. Após a taxotomia.A apoptose das CRR é atrasada em aproximadamente quatro dias após a oxotomia, deixando uma janela temporal para manipulações experimentais realizadas um dia após a oxotomia, e a marcação retrógrada com Flora Gold permite visualizar claramente os corpos celulares das CRR na camada de células ganglionares da retina e os axônios nas fibras da camada de fibras nervosas da retina. Ao imaginar uma preparação planada montada 14 dias após a oxotomia, a maioria das CRR já morreu e algumas CRR remanescentes estão espalhadas entre as microglias retinianas. Quando as CRR entram em apoptose, as microglias fagocitam as células mortas e, como resultado, ficam marcadas celularmente com um traçador fluorescente que foi usado para marcar as CRR, indicado aqui pelas cabeças de seta vermelhas.A aparência do marcador nos fagossomos da micróglia é diferente daquela nas RGCs sobreviventes. A micróglia contém o marcador em fagossomos altamente concentrados, extremamente brilhantes, relativamente grandes e dispersos por todo o seu citoplasma. As RGCs apresentam um padrão de marcação mais difuso, com pequenas vesículas pontiformes que foram transportadas por retrogradação ao longo de seus axônios, preenchendo o citoplasma celular.Essas vesículas indicadas pelas setas brancas são muito menores e apresentam fluorescência menos intensa, permitindo diferenciar RGCs sobreviventes de micróglias. Além disso, as micróglias possuem corpos celulares muito menores e tendem a apresentar uma morfologia ramificada ou amebóide, ao contrário das RGCs, que possuem corpos celulares relativamente grandes e arredondados. Uma vez mascarado, esta técnica pode ser concluída com sucesso em 15 minutos, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante evitar danos ao suprimento sanguíneo da retina, pois a retina irá degenerar se a vascularização for comprometida após este procedimento.Outros métodos, como injeções intraoculares ou injeções no coto do nervo óptico seccionado, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais são os mecanismos envolvidos na apoptose das células ganglionares da retina.

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Neuroscience

Neurociência

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.

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Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultura de neurônios ganglionares da retina de ratos axotomizados com glia de revestimento olfativo, como um modelo in vitro de regeneração axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020). Este vídeo demonstra imagens e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares da retina (RGNs) de ratos axotomizados co-cultivados com células da glia olfativas humanas imortalizadas. Os RGNs são imunomarcados, com somas vermelhos e axônios verdes. As imagens foram...

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