Name: Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Aprenda a anestesiar e imaginar larvas de Drosophila melanogaster usando desflurano para estudos de junções neuromusculares em neurociência. Este método permite imagens de alta resolução com taxa de sobrevivência de 95%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a Andreas Schönle, Max Plank Institute, para Química Biofísica, Alemanha e David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA, para assessoria técnica. Agradecemos a Frank Kötting, European Neuroscience Institute, Göttingen para a construção da câmara de imagem eo dispositivo anestesiados. Este trabalho foi financiado por concessões do Forschung Alzheimer Iniciativa para TMRYZ foi apoiado por uma bolsa da China Scholarship Conselho, SBH por uma bolsa de estudos da Escola de Pós-Graduação em Neurociência Celular e Molecular, Universidade de Tübingen.

A) Assembleia da câmara de imagens <ol><li> Selecione uma larva de estágio escolhido (por exemplo, no início 3 de larvas deixando um intervalo de observação de cerca de 24 horas a 25 ° C até vagando palco). </li><li> Lavar a larva com água para limpá-lo do meio de cultura e DAB-lo seco. </li><li> Brasão centro do elemento inferior da câmara, da região para enfrentar a larva, com uma fina película de óleo de halocarbonos. </li><li> Coloque a larva com o lado ventral de frente para a objetiva do microscópio na câmara (permite junção neuromuscular (MNJ) 26 e 27 a ser trabalhada) (Figura 1 AE). </li><li> Coloque o espaçador de plástico para a camada de petróleo, com as aberturas de ar do para cima da grade face (Figura 1 A). Por favor verifique nesta etapa: A altura do espaçador é aproximadamente metade do diâmetro larval, a largura da fenda deve ser cerca de duas vezes o diâmetro da larva. </li><li> Coloque a câmara de imagem no microscópio </li></ol> B) anestesiados da larva <ol start="7"><li> Conectar as duas entradas da câmara com um dispositivo apropriado anestesiados / vaporizador. Por favor, verifique na frente: A concentração eficaz de desflurano na sala com ar nunca deve exceder a especificada pelas normas de segurança! Apenas um volume muito pequeno total de desflurano é necessária para anestesiar as larvas. A aplicação de 15% (v / v) de 1 desflurano tem provado ser um bom ponto de partida para determinar a concentração ideal para ser usado em um experimento. Por razões de segurança, sugerimos que o vaporizador não deve conter mais do que o necessário desflurano para 2-4 horas de imagens em vivo. </li><li> Mergulhe a outra extremidade do tubo ligado à saída da câmara em um copo de água em seguida, abra as válvulas de controle do fluxo do anestésico na câmara durante cerca de cinco segundos. Por favor verifique nesta etapa: Fazer bolhas de ar sobem na água? Se não for a câmara está com vazamento. </li><li> Fechar as válvulas por cerca de três segundos. </li><li> Monitorar residual movimentos larval no microscópio. Verifique tanto o batimento cardíaco e movimentos musculares. Se for necessário abrir e fechar válvulas, tal como descrito no passo 8 e 9 até anestesiados da larva é completa, em seguida, feche todas as válvulas e começar de imagem. Por favor verifique nesta etapa: Movimento muscular residual ou batimentos cardíacos indica que a larva não está devidamente anestesiados. Anestesiados completo é vital para imagens em alta resolução. A larva não deve normalmente ser anestesiado por mais de 15-20 minutos em um determinado momento. </li></ol> C) Imaging <ol start="11"><li> Identificar a posição correta e imagem da estrutura de interesse (Figura 2-4). </li></ol> D) Recuperação de anestesiados <ol start="12"><li> Depois de imagem é completada deixar o ar na câmara. Por favor verifique nesta etapa: Verifique batimentos cardíacos e contrações musculares da larva por luz halógena transmitida. Como os músculos começam a contratação é seguro para remover a larva da câmara de imagem. </li><li> Retire a câmara do dispositivo anestesiados e removê-lo do microscópio. Desmonte a câmara com cuidado e coloque o purê de larva em meio de cultivo voar. </li><li> Guarde o prato em uma incubadora à temperatura adequada. </li></ol> E) de séries temporais <ol start="15"><li> Repita a 14/02 passos até os pontos de tempo suficiente ter sido obtidos. Alternativa protocolo: Se a larva é para ser fotografada mais de uma vez dentro de um intervalo de 30 minutos pode ser prático para deixá-lo na câmara de imagem até o próximo ponto anestesiados tempo. Repita a 14/07 passos até os pontos de tempo suficiente ter sido obtidos. Por favor verifique nesta etapa: A larva não é para ser mantida na câmara de imagem por mais de duas horas em um momento, nem é para ser anestesiado por mais de 15-20 minutos de cada vez. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Montagem da câmara de imagem. (A) Coloque a larva eo espaçador de plástico para a camada de óleo. (B) Coloque um 22 x 22 mm em lamínula o espaçador e inserir o anel de guia para a câmara de plexiglas, next (C) corrigir a posição da larva com o anel de metal e (D) fechar a câmara. (E) Agora a câmara está pronta para ser montado no microscópio. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Corpo parede músculos em larvas de Drosophila. Músculos e NMJs foram visualizados por expressão de uma proteína de fusão GFP-CD8-Sh 8. Os músculos são mostradas como se observa quando o foco no lado ventral através da cutícula para a larva. In (AC) o músculo mais superficial, 27, é mostrado, em (KL) os músculos mais interiores, 6 e 7, são mostrados. Bar escala: 100 mM, ΔZ entre fatias é 2 m. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Identidade do corpo na parede músculos em larvas de Drosophila. A identidade dos músculos em larvas L3 Drosophila, A3 segmento, é mostrado. Músculos e NMJs foram visualizados por expressão de uma proteína de fusão GFP-CD8-Sh 8. Os músculos são exibidos como se observa quando o foco no lado ventral através da cutícula para as larvas. Na AC o músculo mais superficial, 27, é mostrado, em KL os músculos mais interiores, 6 e 7, são mostrados. Bar escala: 100 mm, ΔZ entre fatias é 2 m. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Identidade de junções neuromusculares de larvas de Drosophila. (AD) NMJs foram visualizados por expressão de uma proteína de fusão DGluRIIA-MRFP 1. O NMJs são mostrados como se observa quando o foco no lado ventral através da cutícula para a larva. Em (AB), o MNJ mais superficial, 27, é mostrado, no CD do NMJs mais interior, 6 e 7, são mostrados. Bar escala: 100 mm, ΔZ entre fatias é 5 mm. (E) e (F) a identidade do superficial (E) e mais interior (F) NMJs é dada como referência.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método apresentado foi desenvolvido inicialmente para estudar sinapses glutamatérgicas sobre os músculos do corpo muro de Drosophila melanogaster larvas. A Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é caracterizada por um estereótipo cito-arquitetura dos músculos e neurônios e é, portanto, ideal para a imagem in vivo. No entanto, o protocolo descrito anestesiados não se limita à imagem do MNJ; a transparência de larvas de Drosophila facilita a adaptação do protocolo descrito para estudar o desenvolvimento de órgãos, a migração de células, transporte de carga axonal e sub-celular de reorganização dentro das células.

Reagentes: <ul><li> Desflurano (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Alemanha) </li><li> Óleo halocarbônico (por exemplo, Voltalef H10S óleo / Atofina, Puteaux, França) </li><li> Fly meio de cultura </li></ul> Equipamento: <ul><li> Microscópio confocal invertida </li><li> Microscópio binocular (por exemplo, Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Alemanha) </li><li> Pincel pequeno, usado para classificar voa </li><li> Incubadora </li><li> Personalizado construído câmara de imagem (Para ver desenhos mecânicos Ref. 3) </li><li> Vaporizador / anestesiados dispositivo (Para detalhes, ver ref. 3) </li></ul>

na imagem in vivo de larvas drosophila intact no sub-celular resolução

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recentes melhorias na imagem óptica, fluoróforos geneticamente codificados e ferramentas genéticas que permite criação eficiente de linhas desejado animal transgênico permitiram processos biológicos a ser estudada no contexto de uma vida, e em alguns casos, mesmo comportando, organismo. Neste protocolo, vamos descrever como para anestesiar as larvas Drosophila intactas, utilizando o anestésico volátil desflurano, para acompanhar o desenvolvimento e plasticidade sináptica das populações a nível sub-celular Resolução 03/01. Enquanto outros métodos úteis para anestesiar Drosophila melanogaster larvas foram descritos anteriormente 4,5,6,7,8, o protocolo aqui apresentado demonstra melhorias significativas devido ao seguinte combinado principais características: (1) Um grau muito elevado de anestesiados, mesmo os batimento cardíaco é preso permitindo a resolução lateral de até 150 nm 1, (2) uma elevada taxa de sobrevivência de&gt; 90% por ciclo anestesiados, que permitem a gravação de mais de cinco pontos temporais durante um período de horas ou dias 2 e ( 3) uma alta sensibilidade permitindo-nos em duas instâncias para estudar a dinâmica de proteínas expressas em níveis fisiológicos. No detalhe, nós fomos capazes de visualizar a subunidade do receptor pós-sináptico de glutamato GluR-IIA expressas por meio do promotor endógeno 1 em linhagens transgênicas e estável da linha de armadilha exon FasII GFP-1. (4) Em contraste com outros métodos 4,7 larvas pode ser trabalhada não apenas vivo, mas também intactos (ou seja, não dissecado), permitindo a observação de ocorrer ao longo de vários dias 1. Os detalhes de vídeo que acompanha a função de partes individuais do in vivo de imagens da câmara 2,3, a correta montagem das larvas, o procedimento anestesiados, como re-identificação de posições específicas dentro de uma larva ea remoção segura das larvas a partir da imagem câmara.

Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de intacta<em&gt; Drosophila melanogaster</emLarvas&gt;. Temos utilizado o anestésico volátil desflurano para permitir imagens repetitivas na sub-celular de resolução e re-identificação de estruturas para até poucos dias<sup&gt; 1</sup&gt;.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Melhorias recentes em imagem óptica, fluoróforos codificados geneticamente e ferramentas genéticas que permitem o estabelecimento eficiente de animais transgênicos desejados...

Avanços na imagem óptica e nas sondas geneticamente codificadas permitiram aos cientistas estudar os processos biológicos de seu interesse em organismos vivos e, em alguns casos, até mesmo em organismos em atividade. Embora grande ênfase tenha sido dada ao estudo do cérebro de mamíferos in vivo, nosso laboratório utiliza um sistema modelo relativamente simples, a junção neuromuscular do trofo, e no vídeo a seguir explicaremos como anestesiar e imaginar larvas de drosófila para acompanhar o desenvolvimento de sinapses individuais ao longo do tempo, em um período que varia de horas a dias, como um método para estudar o desenvolvimento da sinapse. Existem métodos in vivo, mas o protocolo aqui apresentado é caracterizado pelos seguintes aspectos principais.Primeiramente, por meio de um grau muito elevado de anestesia, até mesmo o batimento cardíaco é interrompido, o que é essencial para uma alta qualidade de imagem. Em segundo lugar, pela taxa de sobrevivência de 95% e pela capacidade de adquirir imagens extremamente sensíveis. O seguinte protocolo permite-nos, por exemplo, estudar a dinâmica de receptores de glutamato marcados com GFP e expressos em níveis fisiológicos por seus promotores endógenos.Você aprenderá agora como inserir as larvas na câmara de imagem, como anestesiar a fruta para as larvas, como encontrar uma posição específica dentro das larvas para imagens do estágio signups, e também como recuperar as larvas após a finalização. Antes da imagem in vivo, é importante lavar as larvas. Embora este processo seja simples, é necessário ter cuidado para não danificar as larvas, portanto, pinças nunca devem ser usadas para movê-las.Em vez disso, optamos por movimentos suaves com uma escova. A água utilizada para lavar está em temperatura ambiente e é apenas água da torneira comum, não destilada e sem qualquer detergente. Já podemos ver.Ele movimenta suavemente as larvas para fora do alimento e para dentro da água da torneira fresca para obter bons resultados. Também é essencial manter as larvas na água pelo menor tempo possível. Isso impedirá que a água entre em suas traqueias, o que dificulta a respiração e também o processo de anestesia.Em seguida, preparamos a câmara de imagem. Primeiramente, espalhamos uma camada muito fina de óleo sobre o elemento inferior da câmara. Em seguida, colocamos as larvas sobre esta película de óleo.É importante ter cuidado para que as extremidades dos re não toquem o óleo. Uma vez posicionado, colocamos uma grade espaçadora sobre as larvas aqui. É fundamental que os três canais estejam voltados para cima, permitindo que o ar chegue até as larvas e evitando que fiquem obstruídos com óleo.Agora colocamos uma lamínula sobre o espaçador e verificamos se a larva está posicionada corretamente, ou seja, com o lado ventral voltado para baixo e o lado dorsal, onde terminam as traqueias e podemos visualizar as traqueias, voltado para cima. Agora colocamos o anel adaptador de plástico, bem como um anel metálico, para garantir que a larva seja suavemente comprimida entre as duas lâminas de vidro superiores.Agora fechamos a câmara de imagem e a transferimos para o microscópio confocal para iniciar a aquisição de imagens. Agora ya coloca a câmara de imagem com as larvas montadas em cima do nosso microscópio confocal.Há três tubos saindo da câmara de imagem. Um está conectado ao agente anestésico dióxido de flúor. Um é um tubo de saída e o tubo final permite que ar fresco alcance as larvas.Após conectar a câmara de larvas ao dispositivo anestésico, é importante garantir que a larva esteja corretamente posicionada. Yao então permite que o ar entre no sistema anestésico por meio da bomba. Neste momento, é fundamental assegurar que a pressão na câmara não exceda o valor máximo recomendado.Em seguida, ele coloca a tubulação de saída na água para garantir que haja fluxo de ar. As bolhas no frasco de água demonstram o fluxo de ar. Agora, ele abre lentamente a válvula e permite que o difluoreto flua brevemente pelas tubulações.Após a anestesia inicial, é importante verificar como a larva reage. Se o coração ainda estiver batendo, é necessário aplicar mais anestesia, conforme pode ser observado. Na próxima seção, mostraremos a larva ao microscópio.Agora podemos observar a parte crítica do processo de anestesia pelo microscópio. Inicialmente, os movimentos das larvas podem ser vistos com os músculos continuando a contrair. Assim que os movimentos começam a desacelerar, ya varre de cima a baixo as larvas e observa a anestesia ocorrendo.Os movimentos diminuem e finalmente param. Após a aplicação de múltiplos pulsos de anestesia, podemos observar que a larva parou de se mover e o único movimento visível é devido a ajustes no microscópio. Para determinar o grau de anestesia, é importante verificar as batidas cardíacas.He yao focaliza profundamente na lava, onde principalmente o corpo gordo pode ser visto. É importante notar que a região ao redor do coração é visível e evidente que a batida cardíaca foi interrompida, indicando que a larva está pronta para a imagem. Uma grande dificuldade com o imageamento in vivo é a identificação da junção neuromuscular de interesse.Para ajudá-lo com isso, mostraremos como isso se parece enquanto você examina as larvas. Em seguida, você poderá observar uma junção neuromuscular que geralmente usamos para imageamento. Agora começamos a focar lentamente nas larvas.Começando na superfície da cutícula, você verá alguns músculos aparecendo e desaparecendo. Alguns desses músculos são destacados. O vídeo mostra um construto de fusão artificial contendo o domínio transmembrana CD oito, GFP e a região C-terminal da proteína Canal de Ferro Shaker.Esta construção se localiza em todas as membranas musculares e apresenta aumento na presença na junção neuromuscular. Agora vamos reproduzir o filme mais lentamente e, com a ajuda das figuras dois e três, você poderá identificar músculos individuais conforme eles aparecem e desaparecem. Embora essas moscas sejam particularmente úteis para aprender o imageamento in vivo, geralmente utilizamos larvas que expressam marcadores, rotulando apenas as regiões pós-sinápticas ou pré-sinápticas da sinapse.Como esses marcadores não cobrem toda a superfície muscular, é muito mais difícil identificar a mesma posição nas larvas. Neste vídeo, mostramos receptores de glutamato com marcação RFP. O vídeo mostra o foco sendo ajustado até o labe, e destacamos junções neuromusculares individuais.Vamos mostrar o filme novamente, mais devagar, e você poderá identificar as junções neuromusculares individuais utilizando a figura quatro para ajudá-lo. Agora temos a teoria. Vamos demonstrar um exemplo prático.Agora vamos focar na junção neuromuscular 27 em nossas larvas que expressam GFP no MHC CD oito com shaker. Após aumentar o zoom digital, reposicionamos a junção neuromuscular e então nos movemos na direção C até a região central, para garantir que a larva esteja adequadamente posicionada e que não tenhamos pixels superexpostos ou subexpostos. Você pode ver os pixels superexpostos em vermelho e, comparativamente, quaisquer pixels subexpostos exibidos em azul.Reduzimos a potência do laser e reescaneamos. Agora temos um ganho e intensidade de laser apropriados e, portanto, não temos mais regiões sobrexpostas. Agora é importante marcar a posição da junção neuromuscular na direção C.Primeiramente, marcamos a posição inferior de varredura e, em seguida, a posição superior de varredura para permitir a gravação precisa de toda a pilha de CST. Geralmente, utilizamos um tamanho de pixel de 100 nanômetros por 100 nanômetros e a distância em C é de 500 nanômetros. Se não planejamos realizar desconvolução após a aquisição de imagens para processar nossas imagens, os ganhos são ajustados a um nível apropriado para evitar ruído, mas também permitir o uso de uma intensidade de laser mais fraca para minimizar o desbotamento assim que a pilha de CST estiver concluída.A junção neuromuscular que expressa o construto GFP shaker M-H-C-C-D-H é gravada corretamente. Na seção a seguir, realizamos um processo semelhante, focando nos receptores de glutamato. Para gravar os receptores de glutamato com marcação RFP, novamente focamos através da cutícula e agora observamos as junções neuromusculares individuais no segmento A três.Depois de ampliar a junção neuromuscular direita, reposicionamo-la no centro do campo de visão. Como feito anteriormente, precisamos garantir que não haja pixels superexpostos ou subexpostos. Novamente, torna-se evidente que alguns dos pixels estão superexpostos, então ajustamos as configurações e realizamos uma nova varredura de teste.Os ganhos na potência do laser agora estão ajustados corretamente. Agora é importante definir os limites da pilha CST identificando a posição superior e verificando-a, e depois a posição inferior. Agora podemos começar a escanear os planos individuais da junção neuromuscular.É importante realizar algumas varreduras em branco de seções logo abaixo e acima da junção neuromuscular para evitar perder algumas sinapses posicionadas nesses locais. Após os confocais terminarem a varredura, projetaremos a junção neuromuscular para observar um resultado típico obtido na imagem in vivo. É fundamental manter essa imagem para comparação com varreduras realizadas em pontos temporais posteriores, de modo que a junção neuromuscular possa ser reidentificada e alterações, como novas sinapses ou batões sinápticos, possam ser detectadas.Após a conclusão bem-sucedida da aquisição de imagens, é importante despertar rapidamente a lava e removê-la com agilidade da câmara de imagem. Yao está realizando esse procedimento agora, monitorando continuamente a lava e ajustando o dispositivo de anestesia para que ar fresco, e não apenas flúor, circule pelo sistema.Agora ele coloca a saída da câmara na água e as bolhas de ar demonstram que o ar está fluindo pelo sistema. Ele monitora continuamente as larvas para garantir que a pulsação cardíaca recomece e que as larvas acordem. De forma semelhante ao processo de anestesia, é melhor fornecer às larvas múltiplos pulsos de ar para assegurar um despertar bem-sucedido.Agora podemos observar o que o ya faz através do microscópio. Podemos ver quando ele aplica ar ao sistema. Alterações de pressão são geradas na câmara, o que induz movimentos artificiais nas larvas.Eventualmente, a larva começa a se mover por conta própria, e isso é melhor demonstrado pela iniciativa dos movimentos cardíacos; assim, focamos na larva para observar esses movimentos com maior clareza. Os batimentos rítmicos podem ser observados, indicando o despertar bem-sucedido da larva. Após o despertar bem-sucedido da larva, é importante recuperá-la da câmara de imagem.A larva está na seção inferior da câmara, e assim a parte superior é colocada ao lado. Yara remove o peso de metal e a tampa de plástico. Em seguida, a lamínula é removida e, posteriormente, o espaçador de plástico com as larvas.Ele remove cuidadosamente as larvas do espaçador de plástico com o pincel. Em seguida, mergulha-o brevemente na água e seca para remover qualquer óleo em excesso. A larva é agora colocada em um pouco de ração pré-esmagada e permanece ali até ser necessária novamente.

in-vivo-imaging-of-intact-drosophila-larvae-at-sub-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mesoscópica fluorescência tomografia opera além dos limites de penetração de tecido de corte de microscopia de fluorescência. A técnica é baseada na projeção multi-iluminação e uma descrição do transporte de fótons. Demonstramos in-vivo visualização de corpo inteiro em 3D da morfogênese da GFP-expressando asa em discos...

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Este protocolo discute a dissecção ao vivo...

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Aqui, um protocolo para a implementação de microscopia de expansão em embriões iniciais de Drosophila para obtenção de imagens de super-resolução usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser é apresentado.

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

Aprenda a anestesiar e imaginar larvas de Drosophila melanogaster usando desflurano para estudos de junções neuromusculares em neurociência. Este método permite imagens de alta resolução com taxa de sobrevivência de 95%.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Explorar mais vídeos