Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

As células ganglionares da retina ou RG cs são neurônios do sistema nervoso central que transmitem informações visuais da retina para o cérebro através do nervo óptico. No vídeo complementar, foi demonstrado um método para exodomizar ou cortar os axônios de toda a população RGC como um modelo de morte celular neural apoptótica no sistema nervoso central adulto. Aqui, esse método é acoplado a procedimentos que visam diretamente fatores neurotróficos, RNAs interferentes curtos, plasmídeos ou vetores virais que codificam proteínas anti-ATO em células ganglionares da retina lesionadas ou na retina para atingir a retina globalmente.

Um aparelho de injeção intraocular é montado e usado para injetar substâncias na câmara vítrea do olho para atingir especificamente as células ganglionares da retina. Ou Gelfoam é colocado ou uma seringa de Hamilton é usada para injetar substâncias no nervo óptico. Os resultados de imagem do coto indicam que a sobrevivência das células ganglionares da retina pode ser aumentada pela administração de fatores antiapoptóticos.

Usando essas técnicas, Este método pode ser usado para identificar proteínas envolvidas na apoptose de neurônios adultos no sistema nervoso central. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou ao diagnóstico de doença do sistema nervoso central porque a transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível para apoptose neuronal no SNC adulto Geralmente, aqueles que são novos nessa técnica lutam porque danificam o cristalino ao inserir a pipeta de vidro na câmara vítrea do olho. Para preparar o sistema de seringa para injeções intraoculares, comece removendo qualquer agulha ou porca RN.

Presente em uma seringa Hamilton 1701 de 10 microlitros rn gast tight. Insira o PFA feral no copo de pico feral do encaixe de compressão. Em seguida, insira o encaixe completo na extremidade da seringa e aperte frouxamente a porca RN por cima.

Insira uma extremidade de uma tubulação de pico de 16 polegadas no encaixe de compressão através da abertura na porca RN. Certifique-se de que a tubulação de pico esteja totalmente encaixada. Aperte a porca RN para comprimir o selvagem, o que selará a tubulação de pico.

Repita este processo em ambas as extremidades do acoplador de vidro RN duplo. Conecte a extremidade livre da tubulação de pico a uma extremidade do acoplador de vidro RN duplo apertando o suporte da porca RN. A micropipeta de vidro formará a agulha e o cilindro para o sistema de injeção.

Insira a pipeta de vidro na extremidade livre do acoplador de vidro RN duplo. Aperte a porca RN para fixar a pipeta no lugar. Sob um microscópio de dissecação, crie uma ponta com o diâmetro apropriado segurando uma micropipeta puxada em um ângulo e esfregando a ponta ao longo da cobertura de vidro de uma lâmina de vidro para criar uma quebra.

Idealmente, a ponta final deve ser ligeiramente chanfrada. Em seguida, usando um kit de escorva da Hamilton Syringe Company preenchido com seringa, ligante de tubo de pico, acoplador de vidro RN duplo e a micropipeta de vidro com óleo mineral para uso. Com o sistema de injeção hidráulica, substitua a agulha por uma agulha Hamilton 9 0 0 3 0.

Em seguida, coloque um septo de borracha sobre a agulha Hamilton 9 0 0 3 0 para fornecer uma vedação durante a injeção do óleo mineral. Insira a agulha Hamilton 9 0 0 3 0 da seringa de escorva na parte de trás do corpo da seringa Hamilton de 10 microlitros do sistema de injeção. Pressione o septo firmemente contra a extremidade da seringa para criar uma vedação.

Pressione lentamente o êmbolo óleo mineral passará pelos elementos de vidro do sistema de injeção. Encher a pipeta de vidro. Empurre todo o óleo através do sistema de injeção para remover quaisquer bolhas de ar ao longo do trato.

Se a seringa de enchimento estiver ficando sem óleo mineral, retire lentamente a agulha enquanto distribui óleo constantemente. Para evitar a formação de bolhas de ar, reabasteça a seringa de escorva e injete novamente. Quando todo o sistema estiver cheio de óleo mineral, insira o êmbolo original de 10 microlitros.

A seringa de Hamilton pressiona completamente o êmbolo para remover o óleo mineral adicional do sistema. Limpe a micropipeta de vidro e a extremidade da seringa. Com etanol a 70%, retire o êmbolo até a marca de dois microlitros no cilindro.

A extremidade da micropipeta de vidro se encherá de ar, proporcionando uma zona tampão entre o óleo mineral e o fluido a ser injetado. Encha o cilindro da pipeta colocando a extremidade da micropipeta na solução desejada e retirando o êmbolo da seringa Hamilton. Não mais do que quatro a cinco microlitros de solução serão injetados em um olho de rato adulto para realizar a injeção intraocular.

Comece alternando o fluxo de gás para o acessório da máscara de gás para o quadro estereotáxico. Em seguida, coloque um isof de rato anestesiado com flúor no aparelho estereotáxico. Diminua a concentração de flúor para 2% e monitore a anestesia.

Cubra o animal com um cobertor cirúrgico. Para manter a temperatura corporal durante toda a cirurgia, abra as pálpebras e coloque uma gota de solução anestésica acan. Na superfície da injeção de córnea, são necessárias duas pessoas, uma para inserir a pipeta de vidro na câmara vítrea e manter a posição da pipeta.

E outro para pressionar o êmbolo da seringa, que fornece a solução desejada. Sob um microscópio cirúrgico, segure a micropipeta de vidro e o acoplador de vidro RN duplo, espalhe as pálpebras formando uma forma de V oposta ao local da injeção Com os dedos, o olho se elevará para fora da órbita. Insira suavemente a ponta da micropipeta de vidro através de uma área desprovida de vasos sanguíneos e através da esclera em um ângulo para baixo.

Quando a pipeta penetra na esclera, um pequeno estalo será sentido. A pessoa que segura a seringa deve agora injetar quatro microlitros de solução pressionando o êmbolo até a marca de dois microlitros na seringa. A injeção deve demorar aproximadamente um a dois segundos.

A solução injetada com sucesso passará pela câmara vítrea, manterá a micropipeta estável por aproximadamente cinco segundos e, em seguida, se retirará na mesma direção À medida que a agulha foi inserida, a conjuntiva voltará a bater sobre a pequena abertura, ajudando a selar a punção escleral. Quando a cirurgia estiver concluída, desligue o isof flúor e deixe o animal respirar oxigênio por vários minutos. Cubra a superfície da córnea com pomada oftálmica para os olhos Para evitar o ressecamento da córnea durante a recuperação, remova o animal do dispositivo estereotáxico e coloque-o de volta na gaiola de recuperação.

Manipular as células ganglionares da retina através do transporte retrógrado após a exotomia. Primeiro, execute uma transecção do nervo óptico de acordo com as instruções do protocolo de transecção do nervo óptico de vídeo complementar, 2, 2, 4, 1 medicamentos traçadores. Plasmídeos, siRNAs ou vetores virais podem ser aplicados ao coto do nervo óptico.

Existem dois métodos principais para realizar este procedimento usando espuma de gel ou injeção direta no nervo óptico. Se o método de espuma de gel for usado, certifique-se de que as células ganglionares da retina foram pré-marcadas injetando traçadores retrógrados no colículo superior uma semana antes da taxonomia. Imediatamente após o corte do nervo óptico, colocado um pequeno pedaço de espuma de gel embebido na solução experimental sobre o coto do nervo óptico seccionado, o conteúdo orbital é então devolvido ao local anterior.

Quando o olho retornar a uma posição neutra, use uma pinça para empurrar o pedaço de espuma de gel para baixo na órbita, garantindo que ele permaneça sobre a extremidade do nervo óptico. A técnica de injeção é mais eficaz para a entrega de substâncias que devem ter acesso ao citoplasma do axônio para serem retrotransportadas pelo fluxo plasmático op, Uma seringa Hamilton de 10 microlitros é usada para injetar a solução desejada no nervo óptico seccionado. Uma agulha com um chanfro curto é desejável.

Carregue a seringa com 10 microlitros da solução a ser injetada. Normalmente, plasmídeos de irna ou vetores virais para injetar agarram a borda do nervo óptico com pinças dumont de ponta fina. Insira a extremidade da agulha no nervo óptico, paralelamente ao nervo.

Até que o chanfro não seja mais visível, a agulha inserida será envolta em todos os lados pelo nervo. Uma vez inserida a agulha, aperte suavemente os lados do nervo com a pinça de ponta fina e injete um quarto da solução enquanto gira a seringa. Um quarto de volta no sentido horário ou anti-horário.

Continue repetindo essas etapas até que uma rotação completa da agulha tenha sido concluída e todo o conteúdo da seringa tenha sido injetado. Remova a ponta da seringa do nervo. Deixe qualquer fluido injetado que tenha refluxo do nervo dentro da órbita, pois isso formará uma piscina adicional para absorção pelas extremidades dos axônios.

Retorne o conteúdo orbital à sua posição original, feche a ferida e permita que o animal se recupere. Os animais devem ser alojados de forma independente após a cirurgia. Os analgésicos pós-cirúrgicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de cuidados com o seu animal.

As autoridades e os animais devem ser cuidadosamente monitorados após a cirurgia. Conforme demonstrado neste vídeo, o RGC pode ser direcionado diretamente pela entrega de peptídeos, drogas, vetores, plasmídeos ou siRNAs ao coto do nervo óptico seccionado. Neste exemplo representativo, a marcação retrógrada de ouro fluorado foi realizada e os peptídeos marcados com SI três foram imediatamente injetados no nervo óptico.

A imagem ao vivo da retina foi então realizada para evitar que os peptídeos vazassem do tecido durante a fixação, como pode ser visto aqui, os três peptídeos marcados com SI injetados no nervo óptico foram retrotransportados, muito transportados de volta para o RGC somato na retina. Neste exemplo, SI três siRNAs marcados foram injetados no coto do nervo óptico. Imediatamente após a taxotomia e a imagem ao vivo da retina serem realizadas novamente, os três siRNAs marcados com SI injetados no nervo óptico foram retrógrados, transportados por RG CS conforme indicado por sua colocalização.

Com rotulagem retrógrada de fluorgold Uma vez dominada, esta técnica pode ser executada em segundos se feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante tomar cuidado para evitar danificar a lente. Não se esqueça de que trabalhar com partículas virais pode ser extremamente perigoso, e as diretrizes institucionais para trabalhar com riscos biológicos devem sempre ser seguidas durante a realização desse procedimento.