Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Os neurônios ganglionares da retina ou CNGs são neurônios do sistema nervoso central que transmitem informações visuais da retina para o cérebro através do nervo óptico. No vídeo complementar, foi demonstrado um método para a seção ex sodomizando ou o corte dos axônios de toda a população de CNGs como um modelo de morte celular neural apoptótica no sistema nervoso central adulto. Aqui, este método é combinado com procedimentos que visam diretamente fatores neurotróficos, RNAs de interferência curtos, plasmídeos ou vetores virais que codificam proteínas anti ATO para os neurônios ganglionares da retina lesionados ou para a retina, visando a retina de forma global.

Um aparelho de injeção intraocular é montado e utilizado para injetar substâncias na câmara vítrea do olho, visando especificamente as células ganglionares da retina. Ou se coloca Gelfoam ou se utiliza seringas Hamilton para injetar substâncias no nervo óptico. Os resultados de imagem do coto indicam que a sobrevivência das células ganglionares da retina pode ser aumentada pela administração de fatores antiapoptóticos.

Utilizando essas técnicas, este método pode ser usado para identificar proteínas envolvidas na apoptose de neurônios adultos no sistema nervoso central. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de doenças do sistema nervoso central, pois a secção do nervo óptico é um modelo reprodutível para a apoptose neuronal no SNC adulto. Geralmente, aqueles novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque danificam o cristalino ao inserir a pipeta de vidro na câmara vítrea do olho. Para preparar o sistema de seringa para injeções intraoculares, comece removendo qualquer agulha ou porca RN.

Presente em uma seringa Hamilton gast tight de 10 microlitros, modelo 1701. Insira o feral PFA no feral do copo do pico do encaixe de compressão. Em seguida, insira todo o encaixe na extremidade da seringa e parafuse folgadamente a porca RN por cima.

Insira uma extremidade de um tubo capilar de 1/16 de polegada no encaixe por compressão, passando pela abertura na porca RN. Certifique-se de que o tubo capilar esteja completamente assentado. Aperte a porca RN para comprimir o ferralho, o que selará o tubo capilar.

Repita este processo em ambas as extremidades do acoplador de vidro RN duplo. Fixe a extremidade livre do tubo do pico a uma das extremidades do acoplador de vidro RN duplo apertando a porca RN para cima. A micropipeta de vidro formará a agulha e o corpo do sistema de injeção.

Insira a pipeta de vidro na extremidade livre do acoplador de vidro RN duplo. Aperte a porca RN para fixar a pipeta no lugar. Sob um microscópio estereoscópico, crie uma ponta com o diâmetro apropriado segurando uma micropipeta puxada em um ângulo e esfregando a ponta ao longo do vidro fosco de uma lâmina de microscopia para criar uma quebra.

Idealmente, a ponta final deve ser ligeiramente biselada. Em seguida, utilizando um kit de escorva da Hamilton Syringe Company, encha com óleo mineral a seringa, o conector de tubo, o acoplador de vidro RN duplo e a micropipeta de vidro para uso. Com o sistema de injeção hidráulica, substitua a agulha por uma agulha Hamilton 9 0 0 3 0.

Em seguida, coloque um septo de borracha sobre a agulha Hamilton 9 0 0 3 0 para proporcionar um selo durante a injeção do óleo mineral. Insira a agulha Hamilton 9 0 0 3 0 da seringa de cebamento na parte traseira do corpo da seringa Hamilton de 10 microlitros do sistema de injeção. Pressione firmemente o septo contra a extremidade da seringa para criar um selo.

Pressione lentamente o êmbolo para que o óleo mineral atravesa os elementos de vidro do sistema de injeção, preenchendo a pipeta de vidro. Empurre todo o óleo através do sistema de injeção para remover quaisquer bolhas de ar ao longo do trajeto.

Se a seringa de preenchimento estiver acabando o óleo mineral, retire lentamente a agulha enquanto dispensa constantemente óleo. Para evitar a formação de bolhas de ar, reabasteça a seringa de escorva e injete novamente. Quando todo o sistema estiver preenchido com óleo mineral, insira o êmbolo original da seringa de 10 microlitros.

Com a seringa de Hamilton, pressione completamente o êmbolo para remover o excesso de óleo mineral do sistema. Limpe o micropipeta de vidro e a extremidade da seringa. Com etanol 70%, puxe o êmbolo até a marca de dois microlitros no corpo da seringa.

A extremidade da micropipeta de vidro será preenchida com ar, proporcionando uma zona tampão entre o óleo mineral e o fluido a ser injetado. Encha o corpo da pipeta colocando a extremidade da micropipeta na solução desejada e puxando o êmbolo da seringa Hamilton. Não mais de quatro a cinco microlitros de solução serão injetados no olho de um rato adulto para realizar a injeção intraocular.

Inicie trocando o fluxo de gás para o acessório da máscara facial do estereotáxico. Em seguida, posicione uma rata anestesiada com isoflurano no aparelho estereotáxico. Reduza a concentração de isoflurano para 2% e monitore a anestesia.

Cubra o animal com um cobertor cirúrgico. Para manter a temperatura corporal durante toda a cirurgia, abra as pálpebras e aplique uma gota de solução anestésica acan. Na superfície da córnea, a injeção requer duas pessoas: uma para inserir a pipeta de vidro na câmara vítrea e outra para manter a posição da pipeta.

E outro para pressionar o êmbolo da seringa, que libera a solução desejada. Sob um microscópio cirúrgico, segure a micropipeta de vidro e o acoplador de vidro duplo para RN, abra as pálpebras formando um formato de V oposto ao local da injeção. Com os dedos, o olho será elevado para fora da órbita. Insira suavemente a ponta da micropipeta de vidro em uma área isenta de vasos sanguíneos e através da esclera em um ângulo descendente.

Quando a pipeta penetrar na esclera, será sentido um pequeno estalo. A pessoa que segura a seringa deve agora injetar quatro microlitros de solução, pressionando o êmbolo até a marca de dois microlitros na seringa. A injeção deve levar aproximadamente um a dois segundos.

A solução injetada com sucesso irá percorrer a câmara vítrea, mantenha a micropipeta estável por aproximadamente cinco segundos e, em seguida, retire-a na mesma direção em que a agulha foi inserida; a conjuntiva voltará a cobrir a pequena abertura, ajudando a selar a punção escleral. Após a cirurgia ser concluída, desligue o isoflurano e permita que o animal respire oxigênio por vários minutos. Cubra a superfície da córnea com pomada oftálmica para prevenir o ressecamento da córnea durante a recuperação, depois remova o animal do aparelho estereotáxico e retorne-o à gaiola de recuperação.

Para manipular células ganglionares da retina por meio de transporte retrógrado após exotomia. Primeiro, realize uma transecção do nervo óptico de acordo com as instruções no protocolo de transecção do nervo óptico do vídeo complementar, 2, 2 4, 1 corantes, fármacos. Plasmídeos, siRNAs ou vetores virais podem ser aplicados ao coto do nervo óptico.

Existem dois métodos principais para realizar este procedimento: utilizando espuma de gel ou injeção direta no nervo óptico. Se o método com espuma de gel for utilizado, certifique-se de que as células ganglionares da retina tenham sido previamente marcadas pela injeção de traçadores retrógrados no colículo superior uma semana antes da taxonomia. Imediatamente após o corte do nervo óptico, coloque um pequeno pedaço de espuma de gel embebido na solução experimental sobre o coto do nervo óptico seccionado, e em seguida retorne o conteúdo orbitário à sua posição anterior.

Quando o olho for retornado à posição neutra, use uma pinça para empurrar o pedaço de espuma de gel para dentro da órbita, garantindo que ele permaneça sobre a extremidade do nervo óptico. A técnica de injeção é mais eficaz para a administração de substâncias que precisam acessar o citoplasma do axônio para serem retrotransportadas eficientemente pelo fluxo axoplasmático. Uma seringa gastight de 10 microlitros da Hamilton é usada para injetar a solução desejada no nervo óptico seccionado. Uma agulha com bisel curto é desejável.

Carregue a seringa com 10 microlitros da solução a ser injetada. Normalmente plasmídeos de irna ou vetores virais para injetar, segure a borda do nervo óptico com pinça fina de Dumont. Insira a extremidade da agulha no nervo óptico, paralelamente ao nervo.

Até que o bisel não seja mais visível, a agulha inserida ficará envolvida em todas as laterais pelo nervo. Uma vez inserida a agulha, comprima suavemente os lados do nervo com a pinça de ponta fina e injete um quarto da solução enquanto gira a seringa. Um quarto de volta no sentido horário ou anti-horário.

Continue repetindo esses passos até que uma rotação completa da agulha tenha sido realizada e todo o conteúdo da seringa tenha sido injetado. Remova a ponta da seringa do nervo. Deixe qualquer fluido injetado que reflua do nervo dentro da órbita, pois isso formará um reservatório adicional para absorção pelas extremidades dos axônios.

Retorne o conteúdo orbital à sua posição original, feche a ferida e permita que o animal se recupere. Os animais devem ser acomodados individualmente após a cirurgia. Analgésicos pós-cirúrgicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes do seu comitê de cuidados com animais.

As autoridades e os animais devem ser cuidadosamente monitorados após a cirurgia. Como demonstrado neste vídeo, as CRR podem ser diretamente alvejadas pela administração de peptídeos, fármacos, vetores, plasmídeos ou siRNAs ao coto do nervo óptico seccionado. Neste exemplo representativo, foi realizada marcação retrógrada com ouro fluorescente e três peptídeos marcados SI foram imediatamente injetados no nervo óptico.

A imagemagem em tempo real da retina foi então realizada para evitar que os peptídeos vazassem do tecido durante a fixação, como pode ser observado aqui: três peptídeos marcados com SI foram injetados no nervo óptico e transportados retrogradamente de volta aos somas das CRR na retina. Neste exemplo, três siRNAs marcados com SI foram injetados no coto do nervo óptico. Imediatamente após a transecção, a imagemagem em tempo real da retina foi realizada novamente, e os siRNAs marcados com SI injetados no nervo óptico foram transportados retrogradamente pelas CRR, conforme indicado por sua colocalização.

Com a marcação retrógrada por Fluorgold, uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em segundos, se feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter cuidado para evitar danos à lente. Não se esqueça de que trabalhar com partículas virais pode ser extremamente perigoso, e as diretrizes institucionais para trabalho com agentes biológicos devem sempre ser seguidas durante a realização deste procedimento.