Name: De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Aprenda a montar um microendoscópio de fibra óptica de alta resolução para imagem celular in situ em tempo real. Este método de baixo custo permite visualizar processos celulares em seu microambiente nativo.

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Esta pesquisa foi parcialmente financiada pelo National Institutes of Health, conceder R01 EB007594, o Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de Mama, proposta BCO74699P7, ea Susan G. Komen Foundation conceder 26152/98188972.

1. Assembléia Microendoscope O microendoscope de alta resolução aqui descritas (figura 1) deve ser considerada como uma configuração de base com diversas variações possíveis na montagem e aplicação. Descrevemos em detalhes aqui uma encarnação da plataforma que é projetado para ser usado com proflavina como um agente de contraste fluorescente. Proflavina nuclear é uma brilhante mancha com pico de absorção e emissão de comprimentos de onda de 445 nm e 515 nm, respectivamente. O uso de agentes de contraste outras exigirá que o usuário selecione excitação, emissão e filtros dicróicos de forma adequada. Vários elementos da microendoscope de alta resolução são genéricos e podem ser obtidos de vários fornecedores. Por exemplo, componentes de posicionamento optomechanical estão disponíveis a partir Thorlabs, Newport, Linos, entre outros. CCD câmeras compactas estão disponíveis em empresas, incluindo Point Grey Research, Prosilica e Retiga; sensibilidade da câmera deve ser escolhido com a consideração do brilho do fluoróforo para ser utilizado, bem como a taxa de quadros desejado. De alta potência diodos emissores de luz (LEDs) podem ser obtidas Luxeon, Cree, e Nichia entre outros. Feixes de fibra óptica estão disponíveis a partir Sumitomo, Fujikura, e Schott. Na seleção de componentes para uma aplicação específica, o usuário deve considerar as relações inerentes envolvidos em microscopia de fluorescência entre a concentração de fluoróforo, fotodegradação, a intensidade da iluminação, a sensibilidade da câmera, ganho e tempo de exposição. <ol><li> Conecte o 6 "varas gaiola para o 1.5" hastes da gaiola, para formar um par de 7,5 "longos bastões. Screw essas varas em uma face da unidade de espelho fold. Parafuso de 0,5" varas na face oposta. Deslize o cubo gaiola para as hastes da gaiola, através dos dois mais baixas através de buracos. Parafuso a 2 "varas para a face lateral do cubo gaiola (Figura 1B). </li><li> Conectar a câmera a uma placa de gaiola usando um C-mount para adaptador SM1. Fixe a placa na gaiola 0,5 varas "gaiola, lave com o rosto da unidade de espelho fold. </li><li> Insira o "tubo" lente em um tubo de três lente "longa e segura a lente com um anel de retenção. A distância focal da lente devem ser tais que os núcleos do feixe de fibra ótica são recolhidos por meio de pelo menos dois pixels quando projetadas para a câmera. Gota o filtro de emissão para o tubo em cima do primeiro anel de retenção, e adicionar um outro anel para fixar o filtro no lugar. Observe a convenção orientação filtro indicado pelo fabricante do filtro. Screw o tubo de lente para o lado do gaiola cubo mais próximo à câmera CCD. Note que na figura 1c, esta lente e filtro são mostrados sem o tubo de lente 3 "para maior clareza. </li><li> Conectar a câmera a um computador e ver a imagem na tela. Dirigir o conjunto da gaiola de um objeto distante e deslize o cubo gaiola ao longo dos trilhos até que uma imagem aparece em foco. Bloquear o cubo gaiola neste local. (Este é um método simples de assegurar que a lente do tubo vai formar uma imagem focada, quando combinado com a lente objetiva corrigido ao infinito). </li><li> Insira o espelho dicróico para o titular e em 45 ° lugar no cubo gaiola. </li><li> Parafuso da lente objetiva, através de um RMS para SM1 adaptador de rosca e um tubo de lente ajustável, em face do cubo gaiola em frente à porta da lente do tubo. A z-tradutor pode ser usado no lugar do tubo da lente ajustável para facilitar a focagem. Parafuso de um conector SMA em uma placa de gaiola e montar este nas hastes, aproximadamente à distância de trabalho da lente objetiva. </li><li> Montar um LED em uma placa de gaiola e deslize para a final do 2 "hastes. Adicionar uma lente para um 0,5" tubo de lente de tal forma que quando esse tubo é parafusado no lado do cubo gaiola, ele irá formar uma imagem do LED que enche a abertura parte de trás da lente objetiva. Esta configuração (Kohler iluminação) irá garantir que a face proximal do feixe de fibra óptica é uniformemente iluminado. Adicionar o filtro de excitação para o tubo de lente de 0,5 "e fixe no lugar com um anel de retenção (figura 1c). </li><li> Anexar um conector SMA a um feixe de fibra óptica. Parafuso o pacote SMA conectorizada no receptáculo SMA montado nas hastes da gaiola. Direto da extremidade distal do feixe para uma fonte de luz de banda larga (iluminação fluorescente será suficiente) e observar a imagem da face proximal pacote na câmara CCD. Ajustar a posição da lente objetiva apertando dentro ou para fora do cubo gaiola até que a imagem feixe de fibras aparece em foco. Os núcleos individuais devem ser claramente visíveis (Figura 2). </li></ol> 2. Assembléia Lens GRIN A resolução espacial do microendoscope pode ser aumentado por uma lente de micro ou montagem da lente até a ponta distal do feixe de fibras. Estas lentes estão configurado de modo que em vez de colocar a ponta pacote directamente para o tecido, a dica é fotografada na superfície do tecido com demagnification, aumentando assim a frequência de amostragem espacial imposta pela guid-luzing núcleos do feixe de fibras. O grau de demagnification corresponde ao aumento da resolução espacial, e ao mesmo tempo, a uma diminuição proporcional no campo de visão. Componentes lente gradiente de índice (GRIN) são compatíveis com fibra óptica e estão disponíveis a partir GrinTech, NSG, Schott, entre outros, e pode ser diretamente ligado a ponta distal de um feixe de fibras. <ol><li> Selecione uma lente GRIN com a ampliação desejada e distância de trabalho para sua aplicação. Garantir que o diâmetro da lente excede o do feixe de fibras que você pretende trabalhar. Recomendamos que o feixe de fibras e lente GRIN ser montado em separado de 3 eixos estágios posicionamento manual sob um microscópio de baixa potência ou estereoscópio para um alinhamento preciso antes da colagem. </li><li> Colocar uma gota de cola óptico (por exemplo Norland adesivo de cura UV) em qualquer lente ou o rosto pacote. Traga os dois componentes em contato usando o posicionadores manual. Expor a interface à luz UV para a dose recomendada pelo fabricante. </li><li> Para proteger a lente GRIN ea interface ligado, um pequeno pedaço de tubo de alumínio capilar (Small Parts Inc.) pode ser usado para envolver o conjunto. Deslize o tubo sobre a articulação e seguro em lugar com epóxi. Tubulação do calor shrink pode ser usado para terminar a montagem. </li></ol> 3. Imagem Microendoscope <ol><li> Aplicar o agente de contraste para as células ou tecido a ser trabalhada. Com proflavina (0,01% w / v em PBS), in vitro de imagem de células em cultura pode ser realizada através da incubação de curta duração (&lt;1 minuto) e lavagem completa. Imagens de amostras de tecido ex vivo ou in vivo tecidos é a aplicação tópica de possível após a tintura. Absorção de proflavina nestas condições foi encontrado para ser quase instantânea, com imagem possível dentro de alguns segundos e duradoura por vários minutos. </li><li> Coloque o pacote de fibra óptica em leve contato com a amostra a ser trabalhada. Células quando imagem na cultura ou amostras de tecido ex vivo, recomendamos a montagem da extremidade distal do feixe de fibras em um dispositivo seguro com estágios posicionamento manual em eixos XYZ para a estabilidade durante o exame. </li></ol> 4. Resultados representativos: Quando montada corretamente, o microendoscope funcionará como um microscópio de epi-fluorescência, retransmitida através de um feixe de fibra ótica coerente. Para resultados de imagem ideal, a atenção deve ser dada para garantir que três condições essenciais são atendidas: <ol><li> A face proximal do feixe de fibras deve ser fotografada para a câmera CCD, sem desfocar, a fim de conseguir a resolução completa do sistema. Figura 2a, b, c mostram uma parte de um feixe de fibras fotografada com foco pobres, defocus leve, e bom foco, respectivamente. A focagem é encontrado ajustando a posição axial da lente objetiva em relação à face pacote. </li><li> A face proximal do feixe de fibras deve ser uniformemente iluminado sobre seu diâmetro total (campo de visão). Como descrito no texto do protocolo (1,7), isso é conseguido através da configuração do sistema ótico de iluminação para iluminação Kohler. Figura 2d mostra uma imagem adquirida quando uma amostra uniforme fluorescente é iluminada nesta configuração preferida, com 2e Figura demonstrando o resultado correspondente sob iluminação crítica. Neste último caso, a estrutura do LED é fotografada para o rosto feixe de fibras, resultando no aparecimento deste padrão indesejados sobrepostos na estrutura de amostra real. </li><li> Ambas as faces proximal e distal do feixe de fibras devem ser limpos e livres de arranhões e chips. Figura 2f demonstra a presença de detritos conectado à face pacote, com danos na forma de um pequeno chip em cinco horas no perímetro de fibra. Detritos podem ser removidos do pacote de faces através da limpeza da mesma forma como convencionais ligações de fibras ópticas, com um papel de lente e isopropanol, ou ferramentas padrão de fibra óptica de limpeza. Se uma das extremidades do feixe de fibras está riscado ou quebrado, ou se o pacote de quebra ao longo de seu comprimento, o cara pode ser polida plana pelo manual padrão, ou técnicas de polimento mecânico. Recomendamos 12-15 mM lapping papel para um polonês inicial grosseira, com um polonês final sobre papel 0,5-1,0 mM. </li></ol> Figura 3a mostra imagens de 1483 células in vitro, seguindo rotulagem com a colocação proflavina e luz do feixe de fibras nuas na amostra. Figura 3b mostra a melhora na resolução espacial e redução no campo de visão fornecida por uma lente GRIN 2.5x ligados à ponta pacote. Filme 1 demonstra na imagem in vivo da almofada de gordura mamária em um modelo de mouse. Aqui, um feixe de fibras com 0,5 mm de diâmetro externo (330 mM campo de visão) foi aprovada através de uma agulha calibre 21 e avançado para o tecido. Células de gordura são claramente visíveis, com o movimento, devido ao ciclo cardíaco aparente nesta aquisição de 15frames por segundo. Figura 3c mostra imagens da mucosa oral em voluntários saudáveis ​​humanos, desta vez usando um pacote maior de fibra com 1,5 mm de diâmetro externo (1,4 mm de campo de visão). Em todos os exemplos mostrados, proflavina foi usado como um agente de contraste nuclear rotulagem fluorescente. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Montagem do microendoscope de alta resolução (HRME). (A) Diagrama esquemático do sistema HRME. (B) Assembleia da estrutura de suporte principal optomechanical. (C) A adição de elementos de óptica, iluminação LED, e uma câmera CCD. (D) Fotografia do sistema HRME, embalados em um "x 8" 10 x 2,5 caixa ". <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Configurando o HRME. Exemplos de imagens com o pacote de fibra óptica no (a) foco pobres, (b) perto de bom foco, (c) o foco ideal. Em (d), um alvo uniforme fluorescente na ponta distal do feixe é imaginada sob iluminação Kohler (uniforme). (E) Um objectivo uniforme fluorescente sob iluminação com imagens crítica, com a estrutura aparente fonte sobre o objeto. (F) tecido conjuntivo frouxo e células podem ficar com o rosto feixe de fibras, que também é propensa a danos menores em sua periferia. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagens com a HRME. (A) 1483 células in vitro, fotografada com um feixe de fibras nuas (IGN-08/30), após marcação com proflavina 0,01% (w / v). (B) A cultura de células mesmo 1483 como mostrado em (a), fotografada com um feixe de fibras com lente GRIN 2.5x anexado. (C) Imagem da mucosa oral normal humana in vivo, após aplicação tópica de proflavina 0,01% (w / v). Filme 1. Imagem a almofada de gordura mamária de um rato através da inserção de um feixe de fibras 450 mM diâmetro externo dentro do lúmen de uma agulha calibre 21 passou para o tecido. Proflavina 0,01% (w / v) foi entregue ao site de imagens através da mesma agulha antes da inserção da fibra de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">Clique aqui para assistir ao vídeo</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li>
<li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+in+Barrett%27s+esophagus%3A+a+novel%2C+low-cost+endoscopic+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li>
<li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li>
<li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li>
<li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Inst%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li>
<li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP e DY não têm nada a revelar. RRK detém patentes relativas às plataformas de imagem microendoscópica.

A alta resolução técnica microendoscopy aqui descrito fornece aos pesquisadores em áreas básicas da pesquisa biomédica e clínica com um método flexível, robusto e de baixo custo para a visualização de detalhes celulares in situ. Nós descrevemos um protocolo para a montagem do sistema de imagem e demonstrou a sua utilização em cultura de células in vitro e em animais e tecidos humanos in vivo. Embora os resultados aqui apresentados imagem usada proflavina como um agente de contraste fluorescente, outros grupos têm demonstrado versões do sistema com comprimentos de onda de iluminação LED e filtros escolhida para coincidir com excitação / emissão de espectros de outros corantes 5-7. Resolução e campo de visão são inicialmente determinado pelo espaçamento core-to-core e diâmetro de imagem do feixe de fibra óptica. Temos usado pacotes com aproximadamente 4 mm de espaçamento central-core, e diâmetros de imagem de 330 mM (filme 1), 720 mM (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 mM (Figura 3c). Os feixes menores podem ser passadas através de agulhas bitola estreita e são significativamente mais flexível do que as fibras maiores. Nós e outros oito têm, em alguns casos, notou o aparecimento de emissões de autofluorescência da fibra pacote em si. Ao tentar excitar fluoróforos em comprimentos de onda ultravioleta, ou recolher as emissões na faixa vermelha do espectro, a atenção deve ser dada ao nível de autofluorescência de fibra pacote contribuindo para o sinal total medido. Enquanto a maioria do trabalho microendoscopy alta resolução relatada até o momento, tem utilizado um feixe de fibras nuas, ampliação adicional pode ser fornecida pelo uso de lentes GRIN ligados à ponta distal. Lentes GRIN oferecem uma maneira simples e econômica para aumentar a resolução espacial, embora a sua suscetibilidade a aberrações ópticas e NA limitada é bem reconhecida. Se o desempenho da lente GRIN é inadequado para uma determinada aplicação, GRIN híbrido / objectivos lente esférica 9 ou conjuntos de lentes objetivas 11/10 miniatura podem ser empregadas. O microendoscope de alta resolução aqui descrito opera essencialmente como um grande campo do microscópio epi-fluorescência, portanto não seccionamento óptico (como em microscopia confocal ou não linear) é de se esperar. Em nossa experiência, utilizando 455 nm e luz de excitação proflavina tópica como agente de contraste, a luz é coletada principalmente a partir de uma profundidade correspondente a algumas camadas de células. Este protocolo deve permitir que o leitor a montar o microendoscope de alta resolução sobre a bancada, com um tamanho compacto de 10 &quot;x 8&quot;. Se desejar, o sistema pode ser colocado em uma caixa e os componentes elétricos (LED e uma câmera) alimentado por uma bateria (Figura 1d). Muitas câmeras compactas pode ser alimentado pelo IEEE-1394 (Firewire) e portas USB do computador host.

<table><tbody><tr><td>Câmera CCD</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>Selecionado para uso com proflavina &amp;#8211; outros fluoróforos podem exigir peças diferentes</td></tr><tr><td>Filtro de excitação</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>Selecionado para uso com proflavina &amp;#8211; outros fluoróforos podem exigir peças diferentes</td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>Selecionado para uso com proflavina &amp;#8211; outros fluoróforos podem exigir peças diferentes</td></tr><tr><td>Espelho dicróico</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>Selecionado para uso com proflavina &amp;#8211; outros fluoróforos podem exigir peças diferentes</td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>Lente tubular</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>Selecione o comprimento focal para alcançar a ampliação necessária para a CCD</td></tr><tr><td>Lente condensadora</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de cubo de gaiola</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>Hastes e placas da gaiola</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de espelho dobrável</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de lentes</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (ou SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores / conectores</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>Conectores SMA</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação para LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>Feixe de fibras ópticas</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>IGN-08/30</td><td>Feixes maiores ou menores estão disponíveis (Sumitomo / Fujikura)</td></tr></tbody></table>

de alta resolução de fibra óptica para microendoscopy in situ celular imagem

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Muitos estudos biológicos e clínicos requerem o estudo longitudinal e análise da morfologia e função com resolução nível celular. Tradicionalmente, experiências múltiplas são executados em paralelo, com amostras individuais retirado do estudo em momentos sequenciais para avaliação por microscopia de luz. Várias técnicas foram desenvolvidas intravital, com confocal, multifotônica, e microscopia segundo harmônico todos demonstrando sua capacidade de ser usado para geração de imagens em uma situ. Com estes sistemas, no entanto, a infra-estrutura necessária é complexo e caro, envolvendo sistemas de varredura a laser e complexas fontes de luz. Aqui apresentamos um protocolo para a concepção e montagem de um microendoscope de alta resolução que pode ser construída em um dia utilizando off-the-shelf componentes para EUA em US $ 5.000. A plataforma oferece flexibilidade em termos de resolução de imagem, o campo de visão, operacional e comprimento de onda, e descrevemos como esses parâmetros podem ser facilmente modificados para atender às necessidades específicas do usuário final. Nós e os outros têm explorado o uso do microendoscope de alta resolução (HRME) em cultura de células in vitro 2-5, em 6 excisadas e tecidos de animais vivos 2,5, e em tecidos humanos in vivo 2,7. Usuários relataram o uso de diferentes agentes de contraste fluorescente, incluindo proflavina 2-4, benzoporfirina derivados anel monoacid A 5 (BPD-MA), e fluoroscein 6,7, os quais têm recebido total, ou aprovação de investigação do FDA para uso em seres humanos. De alta resolução microendoscopy, na forma descrita aqui, pode apelar para uma ampla gama de pesquisadores que trabalham nas ciências básicas e clínicas. A técnica oferece uma abordagem eficaz e econômica que complementa microscopia tradicional bancada, permitindo ao usuário realizar de alta resolução, imagem longitudinal in situ.

Em muitas situações biológicas e clínicas, é vantajoso para estudar os processos celulares como eles evoluem no seu microambiente nativa. Aqui, descrevemos a montagem e uso de um microscópio de baixo custo de fibra óptica que pode fornecer imagens em tempo real em cultura de células, estudos em animais e estudos clínicos do paciente.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Muitos estudos biológicos e clínicos exigem o estudo longitudinal e a análise da morfologia e da função com resolução ao nível celular.

Tradicionalmente, estudos biológicos e clínicos que exigem análise microscópica com resolução ao nível celular têm sido realizados executando múltiplos experimentos em paralelo, com amostras individuais removidas do estudo em pontos de tempo sequenciais para avaliação por microscopia de luz, enquanto a microscopia confocal, multiphoton e de segunda harmônica são todas técnicas úteis para imageamento in situ. A infraestrutura necessária é complexa e cara, envolvendo sistemas a laser com varredura e fontes de luz complexas. Aqui demonstramos como montar um sistema de microendoscopia de fibra óptica de alta resolução em um único dia, utilizando componentes comerciais por menos de 5.000 dólares americanos.A plataforma oferece flexibilidade em termos de resolução de imagem, campo de visão e comprimento de onda de operação. Primeiro, monta-se um quadro simples de microscópio de fluorescência em epifluorescência para acomodar uma fonte de luz, filtros ópticos, lentes, um feixe de fibras ópticas e uma câmera CCD. Em seguida, instalam-se as lentes de imagem, que formam uma imagem ampliada do feixe de fibras ópticas sobre a câmera CCD.Uma fonte de LED é então instalada com óptica de iluminação para fornecer luz de excitação fluorescente à amostra. Finalmente, com o microendoscópio montado, a imagem em tempo real revela detalhes em nível celular de amostras marcadas com fluorescência, incluindo culturas in vitro, modelos animais in vivo e seres humanos. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como microscopia confocal ou multiphoton, é que ela é suficientemente simples e econômica, permitindo que pesquisadores de diversas áreas a implementem rapidamente e a personalizem de acordo com suas necessidades específicas.O microendoscópio de alta resolução descrito aqui deve ser considerado uma configuração básica, com várias variações possíveis na montagem e aplicação. Ao selecionar componentes para uma aplicação específica, considere as relações inerentes envolvidas na microscopia de fluorescência entre concentração do fluoróforo, iluminação para fotobranqueamento, intensidade, sensibilidade da câmera, ganho e tempo de exposição. Esta plataforma foi projetada para ser usada com proflavina como agente de contraste fluorescente, mas pode ser configurada para funcionar com outros corantes fluorescentes.Pro flavina é uma coloração nuclear brilhante com comprimentos de onda de absorção e emissão máximos de 445 nanômetros e 515 nanômetros, respectivamente. O uso de outros agentes de contraste exigirá que o usuário selecione adequadamente os filtros de excitação, emissão e dicróico para montar o sistema de microendoscópio; comece conectando duas hastes de seis polegadas a duas hastes de 1,5 polegada para formar um par de hastes com 7,5 polegadas de comprimento. Parafuse as hastes em uma face da unidade de espelho dobrável e, em seguida, instale um espelho com diâmetro de uma polegada.Em seguida, parafuse quatro hastes de 0,5 polegadas na face oposta da unidade do espelho dobrável. Deslize o cubo de enclausuramento sobre as hastes de 7,5 polegadas pelos dois orifícios inferiores passantes. Parafuse as hastes de duas polegadas na face lateral do cubo de enclausuramento.Usando um adaptador de montagem C para SM1, fixe a câmera a uma placa de gaiola. Fixe a placa de gaiola nas hastes de gaiola de 0,5 polegada, alinhada com a face da unidade de espelho de dobra. Selecione uma lente tubular de diâmetro de uma polegada para formar uma imagem do feixe de fibras ópticas na câmera.O comprimento focal da lente deve ser selecionado de modo que a causa do feixe de fibras ópticas seja amostrada por pelo menos dois pixels. Ao projetar a imagem na câmera, insira a lente em um tubo de lente com três polegadas de comprimento e fixe a lente com um anel de retenção. Uma chave de fenda de entalhes é útil para parafusar anéis de retenção em tubos de lente longos.Solte o filtro de emissão dentro do tubo da lente de três polegadas, colocando-o sobre o primeiro anel de retenção, e adicione outro anel para fixar o filtro no lugar. Certifique-se de que a orientação do filtro satisfaça a convenção indicada pelo fabricante do filtro. Parafuse o tubo da lente no lado do cubo de proteção mais próximo à câmera CCD.Esta posição também é mostrada aqui. Observe que, no diagrama, esta lente e filtro são mostrados sem o tubo de lente de três polegadas. Para maior clareza, conecte a câmera a um computador e visualize a imagem na tela.Oriente o conjunto da gaiola em direção a um objeto distante e deslize o cubo da gaiola ao longo dos trilhos até que uma imagem do objeto apareça focalizada. Use uma chave de fenda para apertar os quatro parafusos localizados nos lados do cubo da gaiola. Esses parafusos prendem os trilhos quando apertados, mantendo o cubo na posição.Isso garantirá que as lentes do tubo formem uma imagem focalizada do feixe de fibras na câmera quando combinadas com a lente objetiva corrigida para infinito. Em seguida, insira o espelho dicrótico no suporte e posicione-o a 45 graus no cubo de montagem. Parafuse a lente objetiva por meio de um adaptador de rosca RMS para SM e um tubo de lente ajustável na face do cubo de montagem oposta ao suporte da lente do tubo.Em seguida, parafuse um conector SMA em uma placa de gaiola e monte-a nas hastes aproximadamente à distância de trabalho da lente objetiva. Adicione a placa base e a tampa final aos lados abertos do cubo de gaiola. Depois, monte um LED em uma placa de gaiola e deslize-o até a extremidade das hastes de duas polegadas.Adicione uma lente a um tubo de lente de 0,5 polegadas de modo que, quando este tubo for parafusado ao lado do cubo de gaiola, forme uma imagem do LED que preencha a abertura traseira da lente objetiva. Além disso, adicione o filtro de excitação ao tubo de lente. Nesta etapa, um driver de LED pode ser usado para controlar a intensidade da luz de iluminação utilizando epóxi.Conecte um conector SMA para uma fibra de 1030 mícrons ao feixe de fibras ópticas com campo de visão de 720 mícrons. Para obter detalhes sobre a conexão de fibras ópticas, consulte T Thor Labs, número de peça FN nine six. Um guia para conexão e polimento de fibras ópticas.Parafuse o feixe de conectores SMA na tomada SMA montada na haste da gaiola. Direcione a extremidade distal do feixe em direção a uma fonte de luz ampla; luz fluorescente será suficiente. Em seguida, observe a imagem da face proximal do feixe na câmera CCD. Por fim, ajuste a posição da lente objetiva rosqueando-a para dentro ou para fora do cubo de gaiola.Até que a imagem do feixe de fibras apareça em foco, a causa individual deve ser claramente visível. A resolução espacial do microendoscópio pode ser aumentada mediante a fixação de uma micro-lente ou conjunto de lentes na ponta distal do feixe de fibras. Essas ópticas são configuradas de modo que, em vez de colocar a ponta do feixe diretamente sobre o tecido, a ponta é projetada sobre a superfície do tecido com redução de magnificação.Aumentando assim a frequência de amostragem espacial imposta pela condução da luz causada pelo feixe de fibras. O grau de redução da ampliação corresponde ao aumento na resolução espacial e, ao mesmo tempo, a uma diminuição proporcional do campo de visão. Selecione uma lente grin com a ampliação e distância de trabalho desejadas para a sua aplicação.Certifique-se de que o diâmetro da lente corresponda ao do feixe de fibras com o qual você pretende trabalhar. Monte o feixe de fibras e a lente grin em estágios manuais separados de posicionamento de três eixos sob um microscópio de baixa potência ou estereoscópio para um alinhamento preciso.Em seguida, coloque uma gota de adesivo óptico na lente ou na face do feixe. Usando os posicionadores manuais, aproxime os dois componentes até o contato. Exponha a interface à luz UV na dose recomendada pelo fabricante para curar o adesivo.Para proteger a lente grin e a interface colada, utilize um pequeno comprimento de tubo capilar de alumínio para envolver a junção. Deslize o tubo sobre a junção e fixe-o no lugar com uma gota de epóxi em cada extremidade do tubo; use um tubo termorretrátil para finalizar a montagem. Antes da imagem microendoscópica, aplique o agente de contraste nas células ou no tecido a serem imageados para visualizar as células e o cultivo.Primeiro, remova o meio de crescimento por pipetagem. Em seguida, adicione a solução de proflavina pipetando suavemente no poço. Após uma breve incubação de até um minuto, remova a solução de proflavina por pipetagem e descarte.Lave as células adicionando e removendo solução fresca de PBS ao poço, montando a extremidade distal do feixe de fibras em um suporte fixo com estágios de posicionamento manual nos eixos X, Y e Z para garantir estabilidade. Durante a aquisição de imagens após a aplicação do corante em células ou tecido, posicione o feixe de fibras ópticas em contato leve com a amostra. Visualize a imagem do feixe de fibras ópticas na tela do computador, utilizando o software fornecido pelo fabricante da câmera ou qualquer software personalizado que você deseje desenvolver.Ajuste o tempo de exposição e as configurações de ganho da câmera para obter uma imagem com brilho aceitável. Quando montado corretamente, o microendoscópio funcionará como um microscópio de fluorescência em epifluorescência, com a imagem transmitida por meio de um feixe coerente de fibras ópticas. Para obter resultados de imagem ideais, é necessário garantir que três condições principais sejam atendidas.Primeiro, a face proximal do feixe de fibras deve ser projetada na câmera CCD sem desfoque, a fim de alcançar a resolução máxima do sistema. Aqui. Uma porção de um feixe de fibras é projetada com foco ruim, foco ligeiramente ajustado e bom foco. O foco ideal é encontrado ajustando-se a posição real da lente objetiva em relação à face do feixe.Em segundo lugar, a face proximal do feixe de fibras deve ser iluminada uniformemente ao longo de todo o seu diâmetro. Como descrito anteriormente, isso é obtido configurando a óptica de iluminação para iluminação de colimação. A imagem mostrada aqui foi adquirida quando uma amostra fluorescente uniforme é iluminada nesta configuração preferida.O resultado correspondente sob iluminação crítica é mostrado aqui. A estrutura do LED é projetada sobre a face do feixe de fibras, resultando na aparência desse padrão indesejado sobreposto à estrutura real da amostra. Em terceiro lugar, é importante garantir que ambas as faces, proximal e distal, do feixe de fibras estejam limpas e livres de arranhões e lascas.Neste exemplo, detritos de imagem estão aderidos à face do feixe e um dano na forma de uma pequena lascagem às cinco horas é observado no perímetro da fibra. Os detritos podem ser removidos das faces do feixe mediante limpeza, da mesma forma que conectores ópticos convencionais, utilizando papel de lente e isopropanol ou ferramentas padrão de limpeza para fibras ópticas. Células 1483 foram marcadas com proflavina e o feixe de fibra exposto foi levemente posicionado sobre a amostra.A imagem in vitro é mostrada aqui quando uma lente grin de 2,5 x foi ligada à ponta do feixe, obtendo-se uma melhoria na resolução espacial e uma redução no campo de visão. Realizou-se a imagem in vivo, na qual um feixe de fibras com diâmetro externo de 0,5 milímetro foi passado através de uma agulha de calibre 21 e avançado até o tecido do tecido adiposo mamário de um camundongo, conforme visto neste filme, em que adipócitos são claramente visíveis com movimento devido ao ciclo cardíaco. Neste exemplo, realizou-se a imagem da mucosa oral em um voluntário humano saudável utilizando um feixe de fibras maior, com diâmetro externo de 1,5 milímetro.Em todos os exemplos, a pro flavina foi utilizada como agente de contraste fluorescente para marcação nuclear. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar e montar um microendoscópio de fibra óptica para imageamento de fluorescência em C dois de células e tecidos.

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Research

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