De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Tradicionalmente, estudos biológicos e clínicos que requerem análise microscópica em resolução de nível celular têm sido realizados executando vários experimentos em paralelo com amostras individuais removidas do estudo em pontos de tempo sequenciais para avaliação por microscopia de luz, enquanto microscopia confocal, multifotônica e de segundo harmônico são técnicas úteis para imagens in situ. A infraestrutura necessária é complexa e cara, envolvendo sistemas de laser de varredura e fontes de luz complexas. Aqui demonstramos como construir um sistema de microendoscópio de fibra óptica de alta resolução em um único dia, usando componentes prontos para uso por menos de 5.000 dólares americanos.

A plataforma oferece flexibilidade em termos de resolução de imagem, campo de visão e comprimento de onda operacional. Primeiro, uma estrutura simples de microscópio de epifluorescência é montada para acomodar lentes de filtros ópticos de fonte de luz, um feixe de fibra óptica e uma câmera CCD. Em seguida, são instaladas as lentes de imagem, que formam uma imagem ampliada do feixe de fibra óptica na câmera CCD.

Uma fonte de LED é então instalada com óptica de iluminação para fornecer luz de excitação fluorescente à amostra. Finalmente, com o microendoscópio montado, a imagem em tempo real revela detalhes do nível celular de amostras marcadas com fluorescência, incluindo culturas in vitro, modelos animais in vivo e seres humanos. A principal vantagem dessa técnica em comparação com os métodos existentes, como microscopia confocal ou multifotônica, é que ela é suficientemente simples e barata para que os pesquisadores que trabalham em uma ampla gama de campos possam implementá-la rapidamente e personalizá-la para atender às suas necessidades específicas.

O microendoscópio de alta resolução descrito aqui deve ser considerado como uma configuração básica com várias variações possíveis na montagem e aplicação. Ao selecionar componentes para uma aplicação específica, considere as relações inerentes envolvidas na microscopia de fluorescência entre concentração de fluorol, iluminação de fotobranqueamento, intensidade, sensibilidade da câmera, ganho e tempo de exposição. Esta plataforma foi projetada para ser usada com pró-flavina como agente de contraste fluorescente, mas pode ser configurada para funcionar com outros corantes fluorescentes.

A pró-flavina é uma coloração de núcleo brilhante com comprimentos de onda de pico de absorção e emissão de 445 nanômetros e 515 nanômetros, respectivamente. O uso de outros agentes de contraste exigirá que o usuário selecione a emissão de excitação, e os filtros dicróicos adequadamente para montar o sistema de microendoscópio começam conectando duas hastes de gaiola de seis polegadas a duas hastes de gaiola de 1,5 polegadas para formar um par de hastes de 7,5 polegadas de comprimento. Aparafuse as hastes em uma face da unidade de espelho de dobra e, em seguida, instale um espelho de uma polegada de diâmetro.

Em seguida, aparafuse quatro hastes de 0.5 polegadas na face oposta da unidade de espelho de dobra. Deslize o cubo da gaiola nas hastes da gaiola de 7.5 polegadas através dos dois orifícios de passagem inferiores. Aparafuse as hastes de duas polegadas na face lateral do cubo da gaiola.

Usando um adaptador C para SM um, conecte a câmera a uma placa de gaiola. Prenda a placa da gaiola nas hastes da gaiola de 0.5 polegadas niveladas com a face da unidade do espelho de dobra. Selecione uma lente de tubo de uma polegada de diâmetro para formar uma imagem do feixe de fibra óptica na câmera.

A distância focal da lente deve ser selecionada de forma que a causa do feixe de fibra óptica seja amostrada por pelo menos dois pixels. Quando fotografado na câmera, insira a lente em um tubo de lente de três polegadas de comprimento e prenda a lente com um anel de retenção. Uma chave inglesa é útil para aparafusar e reter anéis em tubos de lentes longos.

Solte o filtro de emissão no tubo da lente de três polegadas em cima do primeiro anel de retenção e adicione outro anel para prender o filtro no lugar. Certifique-se de que a orientação do filtro satisfaça a convenção indicada pelo fabricante do filtro. Aparafuse o tubo da lente na lateral do cubo da gaiola mais próxima da câmera CCD.

Esta posição também é mostrada aqui. Observe que no diagrama, esta lente e filtro são mostrados sem tubo de lente de três polegadas. Para maior clareza, conecte a câmera a um computador e visualize a imagem na tela.

Direcione o conjunto da gaiola para um objeto distante e deslize o cubo da gaiola ao longo dos trilhos até que uma imagem do objeto apareça em foco. Use uma chave de fenda para apertar os quatro parafusos localizados nas laterais do cubo da gaiola. Esses parafusos prendem os trilhos quando apertados, mantendo o cubo na posição.

Isso garantirá que a lente do tubo forme uma imagem focada do feixe de fibras na câmera quando combinada com a lente objetiva corrigida ao infinito. Em seguida, insira o espelho diic no suporte e coloque-o a 45 graus no cubo da gaiola. Aparafuse a lente objetiva por meio de um adaptador de rosca RMS para SM e um tubo de lente ajustável na face do cubo da gaiola oposto ao suporte da lente do tubo.

Depois disso, aparafuse um conector SMA em uma placa de gaiola e monte-o nas hastes aproximadamente na distância de trabalho da lente objetiva. Adicione a placa de base e a tampa da extremidade aos lados abertos do cubo da gaiola. Em seguida, monte um LED em uma placa de gaiola e deslize-o na extremidade das hastes de duas polegadas.

Adicione uma lente a um tubo de lente de 0,5 polegada de modo que, quando esse tubo for aparafusado na lateral do cubo da gaiola, ele forme uma imagem do LED que preenche a abertura traseira da lente objetiva. Além disso, adicione o filtro de excitação ao tubo da lente. Nesta fase, um driver de LED pode ser usado para controlar a intensidade da luz iluminante usando epóxi.

Conecte um conector SMA para uma fibra de 1030 mícrons ao feixe de fibra óptica do campo de visão de 720 mícrons. Para obter detalhes sobre a conectorização de fibra óptica, consulte os laboratórios T Thor, número de peça FN nove seis. Um guia para conectorização e polimento de fibras ópticas.

Aparafuse o feixe de olhais do conector SMA no receptáculo SMA montado na gaiola As hastes direcionam a extremidade distal do feixe para uma fonte de luz de banda larga, a iluminação fluorescente será suficiente. Em seguida, observe a imagem da face proximal do feixe na câmera CCD. Por fim, ajuste a posição da lente objetiva aparafusando ou retirando o cubo da gaiola.

Até que a imagem do feixe de fibras apareça em foco, a causa individual deve ser claramente visível. A resolução espacial do microendoscópio pode ser aumentada anexando uma microlente ou conjunto de lentes à ponta distal do feixe de fibras. Essas ópticas são configuradas de forma que, em vez de colocar a ponta do feixe diretamente no tecido, a ponta seja visualizada na superfície do tecido com ampliação dem.

Aumentando assim a frequência de amostragem espacial imposta pela causa orientadora da luz do feixe de fibras. O grau de ampliação dem corresponde ao aumento da resolução espacial e, ao mesmo tempo, a uma diminuição proporcional do campo de visão. Selecione uma lente de sorriso com a ampliação e distância de trabalho desejadas para sua aplicação.

Certifique-se de que o diâmetro da lente corresponda ao do feixe de fibras. Você planeja trabalhar com. Monte o feixe de fibras e a lente sorridente em estágios de posicionamento manual de três eixos separados sob um microscópio ou estereoscópio de baixa potência para um alinhamento preciso.

Em seguida, coloque uma gota de adesivo óptico na lente ou na face do feixe. Usando os posicionadores manuais, coloque os dois componentes em contato. Exponha a interface à luz UV pela dose recomendada pelo fabricante para curar o adesivo.

Para proteger a lente do sorriso e a interface colada, use um pequeno tubo capilar de alumínio para envolver a junta. Deslize a tubulação sobre a junta e prenda no lugar com a gota de epóxi em cada extremidade da tubulação, use tubulação termorretrátil para finalizar a montagem. Antes da imagem microendoscópica, aplique o agente de contraste nas células ou tecidos a serem visualizados nas células de imagem e na cultura.

Primeiro, remova o meio de crescimento com peppe. Em seguida, adicione a solução de pró-flavina pipetando suavemente no poço. Após uma breve incubação de até um minuto, remover a solução de pró-flavina com peppe e eliminar.

Enxágue as células adicionando e removendo a solução fresca de PBS no poço, monte a extremidade distal do feixe de fibras em um acessório seguro com estágios de posicionamento manual no eixo x, Y, Z para estabilidade. Durante a imagem após a aplicação do corante nas células ou tecidos, coloque o feixe de fibra óptica em contato leve com a amostra. Visualize a imagem do feixe de fibra óptica na tela do computador, usando o software fornecido pelo fabricante da câmera ou qualquer software personalizado que você queira desenvolver.

Ajuste o tempo de exposição e as configurações de ganho da câmera para obter uma imagem com brilho aceitável. Quando montado corretamente, o microendoscópio funcionará como um microscópio de epifluorescência retransmitido através de um feixe de fibra óptica coerente. Para obter os melhores resultados de imagem, deve-se prestar atenção para garantir que três condições principais sejam atendidas.

Primeiro, a face proximal do feixe de fibras deve ser visualizada na câmera CCD sem desfoque para atingir a resolução total do sistema. Aqui. Uma parte de um feixe de fibras é fotografada com foco ruim, foco leve e bom foco. O foco ideal é encontrado ajustando a posição real da lente objetiva em relação à face do feixe.

Em segundo lugar, a face proximal do feixe de fibras deve ser uniformemente iluminada em todo o seu diâmetro. Conforme descrito anteriormente, isso é obtido configurando a óptica de iluminação para iluminação cola. A imagem mostrada aqui foi adquirida quando uma amostra fluorescente uniforme é iluminada nesta configuração preferida.

O resultado correspondente sob iluminação crítica é mostrado aqui. A estrutura do LED é visualizada na face do feixe de fibras, resultando no aparecimento desse padrão indesejado sobreposto à verdadeira estrutura da amostra. Em terceiro lugar, é importante garantir que as faces proximal e distal do feixe de fibras estejam limpas e livres de arranhões e lascas.

Neste exemplo, os detritos da imagem são fixados na face do feixe e o dano na forma de um pequeno chip às cinco horas é visto no perímetro da fibra. Os detritos podem ser removidos das faces do feixe limpando da mesma forma que os conectores de fibra óptica convencionais com papel para lentes e isopropanol ou ferramentas de limpeza de fibra óptica padrão. 1483 células foram marcadas com pró-flavina e o feixe de fibras nuas foi levemente colocado na amostra.

A imagem in vitro é mostrada aqui quando uma lente de sorriso de 2,5 x foi colada à ponta do feixe, uma melhoria na resolução espacial e redução no campo de visão foi alcançada. A imagem in vivo em que um feixe de fibras com um diâmetro externo de 0,5 milímetro foi passado através de uma agulha de calibre 21 e avançou para um tecido de almofada de gordura mamária de camundongo foi realizada como visto neste filme, os adipócitos são claramente visíveis com movimento devido ao ciclo cardíaco. Neste exemplo, a imagem da mucosa oral em um voluntário humano saudável foi realizada usando um feixe de fibras maior com um diâmetro externo de 1,5 milímetro.

Em todos os exemplos, a pro flavina mostrada foi usada como agente de contraste fluorescente de marcação nuclear. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e montar um microendoscópio de fibra óptica para imagens de fluorescência em C duas de células e tecidos.