Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

Fatias de hipocampo de roedores são freqüentemente usadas no estudo da função sináptica e plasticidade de mamíferos. Aqui demonstramos um protocolo para obter e estudar fatias de ratos e camundongos idosos, que têm crânios mais grossos e tecido conjuntivo mais resistente do que ratos e camundongos mais jovens. Essas características podem atrasar a extração e/ou dissecação do cérebro e, consequentemente, negar ou exagerar as diferenças reais de idade na função sináptica e na plasticidade.

Além disso, o envelhecimento e a patologia amilóide podem exacerbar os danos ao hipocampo sofridos durante o procedimento de dissecção, complicando ainda mais quaisquer inferências extraídas da avaliação fisiológica. Nesta demonstração, discutimos as etapas tomadas durante os procedimentos de extração e dissecção para minimizar esses problemas. Primeiro, o cérebro é rapidamente extraído e colocado em gelo, frio, baixo teor de cálcio, líquido cefalorraquidiano artificial.

Os campi do hipopótamo são então removidos suavemente em um estágio de dissecação gelada, e as fatias do hipocampo são preparadas usando um vibrato e incubadas em cálcio oxigenado contendo A CSF. Finalmente, os potenciais e correntes sinápticas são evocados em múltiplas sub-regiões do hipocampo e os resultados obtidos demonstram os efeitos do envelhecimento e/ou patologia semelhante à doença de Alzheimer na função sináptica e plasticidade. O uso adequado dessa técnica tem implicações para o declínio cognitivo relacionado à idade e demência devido à doença de Alzheimer.

Isso ocorre porque a disfunção sináptica está entre os primeiros biomarcadores desses sintomas clínicos que demonstram esse procedimento. Hoje será o Dr.Chris Norris, o PI do laboratório Ao lado de uma grande pia. Prepare a área de dissecção para remoção do cérebro e dissecção do hipocampo.

Inclua uma toalha de papel dobrada, uma lâmina de bisturi número 11, tesoura BB, ursos de osso e uma ferramenta de hipocampo, uma espátula dupla especializada de ferramenta cirúrgica fina. Coloque também uma pequena tesoura cirúrgica, uma espátula fina, pipeta de plástico, papel de filtro watman, uma placa de Petri de vidro de 100 milímetros cheia de gelo, uma colher de plástico e um copo de cálcio parcialmente descongelado. Um LCR coberto com param.

Após a decapitação do rato. O cérebro deve ser extraído o mais rápido possível. Coloque a cabeça na toalha de papel usando o bisturi rapidamente faça uma incisão no meio do couro cabeludo do osso nasal ao osso occipital.

Certifique-se de cortar completamente o músculo cutâneo, expondo totalmente as suturas do crânio. Segure a cabeça com firmeza e corte as placas occipital, parietal e frontal ao longo da sutura da linha média. Certifique-se de manter a tesoura inferior firmemente contra a superfície interna do crânio e longe do cérebro.

Isso é fundamental para evitar goivagens inadvertidas. Próximo slide. Os jurados de Ron sob a placa parietal esquerda e apertam as mandíbulas, rolando para cima e para frente para puxar as placas parietal e occipital para longe.

Se necessário, use os jurados de Ron para remover a placa frontal esquerda também. Repita para o outro hemisfério. Uma vez que as placas são deslocadas, use jurados Ron ou tesoura para puxar suavemente ou cortar qualquer dura-máter que possa estar presa às placas temporais e esticada na superfície do cérebro.

Agora deslize os jurados de Ron entre o cérebro e a placa temporal direita, mantendo a pressão em direção ao crânio e longe do cérebro. Aperte e gire a placa temporal até ouvir ou sentir um estalido. Repita para o lado esquerdo.

Deslize a espátula larga à frente da ferramenta hipocampal entre a superfície ventral do cérebro e as placas inferiores do crânio até que esteja completamente sob o cérebro. Mova-o lateralmente de um lado para o outro e para frente e para trás algumas vezes para cortar os nervos cranianos intactos usando a ferramenta do hipocampo. Retire o cérebro e mergulhe-o em uma cobertura de LCR sem cálcio com Parfum e deixe esfriar por cerca de um minuto.

Para extrair os campos de hipopótamo, use uma colher para recuperar o cérebro do LCR A e coloque-o em um papel watman umedecido em LCR na tampa de uma placa de Petri gelada. Usando a lâmina do bisturi, remova o cerebelo e aproximadamente um quarto dos lobos frontais rostrais. Agora corte a fissura intra-hemisférica para separar completamente os dois hemisférios.

Coloque um hemisfério de volta na raspadinha do LCR A e coloque o outro no estágio de dissecação, de modo que o plano coronal do lobo frontal esteja voltado para baixo no tronco encefálico branco e o mesencéfalo deve ser facilmente distinguido do córtex sobrejacente rosa ou acinzentado. Localize o calo no mesencéfalo. Estes se parecerão com dois botões brancos e estarão no topo do cérebro.

Nesta orientação, segure suavemente o mesencéfalo no lugar com uma tesoura e deslize a espátula entre o calo e o córtex. Em seguida, puxe suavemente o tronco cerebral, o mesencéfalo e o tálamo. O tecido conjuntivo ou a vasculatura podem precisar ser cortados com uma tesoura.

Use a ponta afiada da espátula para cortar o fórnix. Feixe de fibras brancas localizado na porção dorsal anterior do hipocampo. Com a tesoura, continue a puxar suavemente o tronco cerebral, o mesencéfalo e o tálamo sem separá-lo completamente do resto do cérebro.

O fi branco das fibras que formam uma hipérbole rasa na parte inferior do hipocampo agora deve ser visível nessa orientação. Usando a pipeta de transferência, esguiche suavemente um pouco de LCR A na lacuna abaixo do FIA para ajudar a separar o hipocampo do córtex. Deslize suavemente a espátula para dentro dessa lacuna e, enquanto segura o tronco cerebral, o mesencéfalo e o tálamo firmemente com a tesoura, role o hipocampo para longe suavemente qualquer córtex restante, vasos sanguíneos e substância branca longe do hipocampo.

Dous com alguns mililitros de A CSF. Usando a pipeta de transferência, mantenha o tecido úmido e frio com uma lama de LCR. Em seguida, remova o outro hemisfério e repita a dissecção para a seção hipopótamo-rato Campi.

Encha o reservatório do vibrato com um LCR gelado, sem cálcio, de modo que o estágio de corte e a lâmina fiquem completamente submersos. Use um bisturi para cortar as pontas rostrais e mimadas de cada hipocampo e coloque-as juntas nas superfícies rostrais com o giro dentado de cada hipocampo voltado um para o outro. Cole o tecido cerebral em um bloco de montagem e transfira-o para o estágio de seccionamento do vibrato.

Para experimentos de fisiologia sináptica, são recomendadas seções de 400 micrômetros. Usando uma pipeta de transferência de boca larga, transfira as fatias para uma pequena placa de Petri contendo sem cálcio gelado. Um CSF.

Uma vez que o corte é concluído, as fatias são transferidas para a câmara de retenção, preenchida com cálcio oxigenado contendo A CSF. Gradualmente, traga a câmara de 27 graus para 32 graus Celsius para realizar gravações extracelulares básicas. Em cortes agudos, a câmara de registro é disposta no estágio do microscópio, de modo que o LCR A pré-guerra é alimentado por gravidade através de um regulador de fluxo e removido por uma linha de vácuo central.

Com um pincel pequeno, transfira uma fatia para a câmara de gravação de modo a que fique submersa em um LCR e apoiada na rede inserida. Deixe a fatia se aclimatar por 10 a 15 minutos. Enquanto a fatia está se aclimatando, ligue o estimulador ou isolador de estímulo e diminua a saída para zero.

Em seguida, posicione um eletrodo estimulante sobre a fatia na região do átomo de raio do estrato de ca dois perto da borda de ca três. Abaixe o eletrodo de gravação no átomo de raio de um estrato apenas quebrando a superfície da fatia. Aumente a saída do estimulador para um nível moderado aqui.

O isolador de estímulo é definido em cerca de 150 microamperes. Abaixe lentamente o eletrodo de estimulação em pequenos intervalos até que um artefato de estímulo seja registrado. Em ca um, continue a abaixar lentamente os eletrodos de estimulação e registro em intervalos enquanto adquire respostas de CA um.

Até que o voleio de fibra e as amplitudes do potencial pós-sináptico excitatório atinjam níveis máximos usando um programa de aquisição de software como o grampo X, estabeleça uma curva de força sináptica. Em seguida, use o software para fornecer estímulos em uma variedade de intensidades e registrar a atividade correspondente em cerca de um. A faixa e o número de níveis de intensidade de estímulo usados devem ser suficientes para gerar uma curva sigmoidal quando plotados em relação aos valores de FV ou EPSP.

Em seguida, para investigar a plasticidade sináptica, redefina a intensidade do estímulo para cada fatia para que uma resposta de um milivolt seja obtida. Inicie a estimulação basal a uma frequência de 0,033 hertz EPSP. Os valores de inclinação devem ser estáveis por pelo menos 20 minutos antes da indução de LTP de potenciação de longo prazo ou depressão de longo prazo LTD.

Para registrar um período de linha de base, use um arquivo de parâmetro X de grampo para estimular e gravar a cada 30 segundos. Em seguida, para induzir LTP, abra um arquivo de parâmetro separado para induzir LTP usando um segundo trem de estimulação de 100 hertz ou várias rajadas curtas de estimulação de 200 hertz administradas a cada 200 milissegundos para indução de LTD. Forneça 900 pulsos de estímulo a uma taxa de um hertz.

Após o estímulo, os trens voltam para o arquivo de parâmetros da linha de base e coletam respostas sinápticas por 60 minutos ou mais. Compare os valores de inclinação de EPSP obtidos antes e 60 minutos após a estimulação de alta baixa frequência para determinar a presença de LTP indicada pelo aumento da força sináptica ou LTD indicada por uma diminuição na força sináptica. Acredita-se que ambos os processos reflitam mecanismos críticos para o aprendizado e a memória.

Aqui, curvas de força sináptica representativas de duas fatias diferentes do hipocampo de dois A PP PS. Um camundongo é mostrado. Um camundongo foi tratado com um novo reagente viral adeno-associado anti-inflamatório. O outro foi tratado com um reagente viral controlado.

Como pode ser visto quando um número semelhante de fibras pré-sinápticas é ativado em todas as condições de tratamento. Quando os grupos mostram amplitudes de FV semelhantes às indicadas no eixo x, a curva de fatia do reagente é deslocada para a esquerda, indicando maiores amplitudes de EPSP. Esses dados demonstram que a força sináptica basal é maior no reagente que uma fatia tratada mostrou.

Aqui estão os resultados dos experimentos LTP realizados nas mesmas fatias. Observe que os valores de inclinação de EPSP no reagente uma fatia são muito maiores em relação à fatia de controle durante a linha de base de uma hora após a entrega da estimulação de 100 hertz, indicando que a LTP estava presente na fatia do reagente, mas não na fatia de controle. Esta figura mostra como eram as formas de onda EPSP no reagente A e nas fatias de camundongos de controle antes e 60 minutos após a administração da estimulação de 100 hertz.

O aumento na inclinação do EPSP no período pós-100 hertz é muito óbvio no reagente uma fatia indicativa de LTP juntos. Os experimentos nas figuras mostradas até agora indicam que o reagente A aumenta a força sináptica e melhora os déficits de LTP. Em um PP PS em camundongos, experimentos semelhantes foram realizados em LACS hipocampal de ratos idosos.

Aqui, são mostradas as curvas de força sináptica de duas fatias diferentes do hipocampo de um rato tratado com um novo anti-inflamatório e outro rato tratado com reagente de veículo de controle. Observe que essas curvas são muito semelhantes para as duas fatias, indicando que a droga A tem pouco efeito na força sináptica basal. Esta figura mostra os resultados de experimentos LTD realizados nas mesmas fatias.

Observe que, típicos para ratos idosos, os valores de inclinação de EPSP na fatia tratada com veículo são reduzidos na linha de base de uma hora após a entrega de uma de sua estimulação. No entanto, os valores de inclinação de EPSP na fatia de droga mostram pouca ou nenhuma depressão, indicando a ausência de LTD mostradas aqui são as formas de onda de EPSP da droga A e fatias de rato de veículo antes e 60 minutos após a administração de uma estimulação de hertz. A diminuição da inclinação do EPSP no período pós-um hertz é muito óbvia na fatia do veículo, mas não na droga uma fatia junta.

Os resultados nessas figuras mostram que a droga a melhora as diferenças de plasticidade em ratos idosos que bloqueiam a indução de LTD, mas não afeta a função sináptica basal. Esses dados mostram que múltiplos parâmetros de função sináptica e plasticidade em ratos idosos e camundongos modelo de Alzheimer podem ser modulados por tratamentos experimentais e destacam a utilidade de fatias agudas do hipocampo para investigar o potencial nootrópico e/ou neuroprotetor de novos medicamentos e reagentes experimentais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de equilibrar sua velocidade e extrair o cérebro com sua precisão e suavidade e dissecar, fatiar e manusear o hipocampo para medidas eletrofisiológicas.