Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 1:30 min. • March 4th, 2025
Comece com proteínas do LCR, incluindo alfa-sinucleína fosforilada, um biomarcador de doenças neurodegenerativas.
Adicione um tampão de carregamento contendo um detergente, um agente redutor e um corante de rastreamento.
Aqueça para desnaturar as proteínas e, em seguida, coloque-as em um gel SDS-PAGE.
Realize eletroforese para separar as proteínas por peso molecular em bandas distintas.
Incube o gel em um tampão de blotting com agitação.
Em seguida, transfira eletro-as bandas de proteína do gel para a membrana.
Trate a membrana com um fixador para reter a proteína na membrana e depois lave.
Incube com uma solução de bloqueio contendo anticorpos primários e inibidores da fosfatase para manter a fosforilação da alfa-sinucleína.
Os anticorpos interagem exclusivamente com a alfa-sinucleína fosforilada e os reagentes bloqueadores bloqueiam locais de interação inespecíficos e depois são lavados.
Introduza anticorpos secundários conjugados com enzimas que interagem com anticorpos primários e, em seguida, lave.
Adicione um substrato quimioluminescente, interagindo com enzimas e gerando uma quimioluminescência.
Uma banda quimioluminescente confirma a presença de alfa-sinucleína fosforilada.