JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 1:22 min • March 4th, 2025
Comece com um tecido cerebral humano em um tampão de lise.
Homogeneizar o tecido com um homogeneizador para liberar proteínas, incluindo ácido glutâmico descarboxilase, ou isoformas da enzima GAD, essenciais para a função cerebral.
Incubar o homogeneizado no gelo e, em seguida, centrifugar para peletar os detritos. Colete o sobrenadante contendo proteínas.
Adicione um tampão de carregamento contendo um detergente e um agente redutor para desnaturar as proteínas.
Carregue esta amostra e um marcador molecular em um gel SDS-PAGE gradiente e eletroforese para separar as proteínas em bandas distintas.
Electroblot as proteínas do gel em uma folha de membrana.
Adicione um agente de bloqueio para evitar a associação não específica.
Incubar com anticorpos primários específicos da isoforma GAD que se ligam às suas isoformas receptivas de GAD.
Lave para remover anticorpos não ligados.
Incubar com anticorpos secundários marcados com fluorescência.
Lave novamente e visualize as bandas de proteína em um sistema de imagem.
Detectar as bandas GAD através de fluorescência e confirmar as suas diferenças de peso molecular utilizando o marcador.