Manipulação de células de placas neurais por meio de nanoinjeção in utero em um modelo de camundongo embrionário

Prenda uma rata grávida anestesiada com seu útero exposto contendo embriões pré-neurulação. Nesse estágio, a placa neural está aberta e diretamente exposta ao líquido amniótico.

Posicione os embriões selecionados em uma placa de Petri com uma membrana elástica para estabilizá-los. Prenda os embriões e aplique solução salina para hidratação.

Alinhe a sonda de ultrassom sobre o embrião e meça o diâmetro da cavidade amniótica para calcular o volume ideal de injeção.

Posicione uma agulha de nanoinjeção contendo uma solução lentiviral de alto título acima do embrião alvo em um ângulo quase perpendicular.

Injete um pequeno volume preciso na cavidade amniótica, retraia suavemente a agulha e remova a sonda de ultrassom.

Empurre suavemente os embriões de volta para dentro do camundongo.

O lentivírus injetado se funde com as células da placa neural, liberando seu material genético, que sofre transcrição reversa em DNA e é integrado ao genoma do hospedeiro.

Isso permite a manipulação estável de genes nas células da placa neural, apoiando potenciais aplicações terapêuticas.

Usando uma pinça, segure o tecido entre os embriões e retire cuidadosamente os dois chifres uterinos do abdômen. Conte e numere os embriões, do ovário ao colo do útero ou do colo do útero ao ovário, em ambos os lados.

Em seguida, com um cotonete úmido, empurre suavemente todos os embriões de volta para a cavidade abdominal, exceto os três primeiros a serem injetados. Em seguida, coloque uma gota de PBS em uma membrana elástica colada à abertura central redonda de uma placa de Petri modificada disponível comercialmente e segure-a imediatamente acima dos embriões. Insira uma pinça fechada na incisão do elástico e, em seguida, solte a pinça para abrir a incisão elástica, deixando cair o líquido sobre os embriões.

Usando uma pinça, puxe a seção do útero correspondente aos três embriões através do elástico e empoleire suavemente a placa de Petri no abdômen do camundongo. Usando quatro pés de argila, prenda e prenda a placa de Petri acima do abdômen para reduzir a pressão sobre o mouse e também reduzir a sensibilidade da imagem à respiração e aos batimentos cardíacos do mouse. Em seguida, usando uma pinça e um cotonete úmido, ajuste o útero e o elástico para garantir que o elástico seja selado ao redor da pele do camundongo, evitando vazamento de PBS.

Em seguida, para fixar o útero, pressione o cilindro de argila de modelagem para baixo à direita dos embriões ou útero e adicione PBS à placa de Petri até que os embriões e o útero estejam totalmente cobertos com o PBS. Para facilitar o registro das injeções, mergulhe a sonda de ultrassom no PBS e ajuste o mouse ou a mesa cirúrgica para que o primeiro embrião fique alinhado com a sonda de ultrassom. Examine todos os três embriões e inspecione as cavidades amnióticas.

Em seguida, usando a máquina de ultrassom, meça o diâmetro da cavidade amniótica para determinar o volume de injeção apropriado. Usando o controlador de injeção, defina os volumes de injeção determinados e a velocidade de injeção para lento, com uma taxa de injeção de 23 nanolitros por segundo. Depois de abaixar a agulha no PBS, usando as rodas principais do sistema de trilhos, pressione Esvaziar no controlador do nanoinjetor até que o líquido atinja a ponta da agulha.

Em seguida, retire a agulha do PBS e pressione Injetar para verificar se uma gota do volume desejado aproximado foi descarregada. Abaixe a agulha no PBS novamente e mova o nanoinjetor com a roda do plano Y no micromanipulador para alinhar a agulha com a sonda de ultrassom e o embrião. Ajuste o ângulo da agulha com a roda do ângulo de injeção para garantir um ângulo de injeção quase perpendicular em relação à parede uterina.

Em seguida, usando a roda de injeção no micromanipulador, insira a agulha na cavidade amniótica em um movimento. Se a ponta da agulha desaparecer da imagem de ultrassom, mova a sonda para frente ou para trás para colocar a agulha de volta em foco. Em seguida, injete o volume desejado pressionando Injetar pelo número apropriado de vezes.

Após a injeção do volume necessário, aguarde 5 a 10 segundos antes de retrair a agulha com um movimento suave.

Em seguida, levante a sonda de ultrassom e a agulha do PBS usando o micromanipulador, afastando a agulha do operador para evitar danos e ferimentos.

Usando uma pinça, coloque o primeiro e o segundo embriões de volta no abdômen, empurrando-os suavemente através do elástico.

Depois que todos os embriões com cavidades amnióticas ideais tiverem sido injetados, empurre suavemente os embriões e o útero de volta para o abdômen do camundongo.