Manipulação optogenética de circuitos neurais para a transição do sono para a vigília em camundongos

Prenda um mouse anestesiado com o crânio exposto em uma estrutura estereotáxica.

O núcleo do leito cerebral da estria terminal (BNST) contém neurônios transduzidos viralmente que expressam canais catiônicos sensíveis à luz.

Faça furos no crânio, insira fibras ópticas e prenda-as com parafusos de suporte e cimento dentário.

Faça furos adicionais para posicionar um conjunto contendo eletrodos de eletroencefalografia (EEG) e eletromiografia (EMG) e prenda-o com adesivo.

Exponha os músculos do pescoço para inserir os fios do eletrodo EMG e, em seguida, permita a recuperação.

Conecte o mouse a um sistema de gravação, coloque-o em uma câmara experimental e deixe-o dormir.

Forneça luz através da fibra óptica para ativar os canais catiônicos sensíveis à luz, desencadeando o influxo de cátions que gera potenciais de ação.

Os sinais se propagam para regiões reguladoras do sono e promovem a vigília.

Registre os sinais de EEG para monitorar a atividade cerebral e os sinais de EMG para detectar a atividade muscular para observar a transição do sono para a vigília.

Para eletroencefalograma, ou EEG, e eletromiograma, ou EMG, implante de eletrodo, primeiro solde dois fios de aço inoxidável dos quais um milímetro de isolamento foi removido de ambas as extremidades para os eletrodos EMG e coloque o centro dos eletrodos no bregma. Em seguida, marque a posição de cada eletrodo de EEG.

Para determinar a posição do implante de fibra óptica, conecte uma ponteira de fibra óptica ao manipulador e gire o braço do manipulador em um ângulo de mais ou menos 30 graus contra uma linha horizontal. Coloque a ponta de fibra no bregma e registre as coordenadas. Mova a ponta para a linha de inserção desejada e marque a posição no crânio e a posição do parafuso de ancoragem ao lado do local de inserção.

Use a broca odontológica para perfurar o crânio em cada local e use o manipulador para inserir suavemente a fibra óptica até que ela atinja acima do BNST. A ponteira deve repousar sobre o crânio restante. Prenda a fibra ao crânio com um parafuso de ancoragem, tomando cuidado para não quebrar a dura-máter ou danificar qualquer tecido.

Em seguida, cubra a fibra e aparafuse com cimento dental fotopolimerizável. Em seguida, faça furos para eletrodos de EEG/EMG e insira a ponta do primeiro eletrodo em um orifício. Segurando o implante com uma mão, aplique o adesivo de cianoacrilato no espaço entre o crânio e o eletrodo e insira o eletrodo no restante do caminho, tomando cuidado para não danificar nenhum tecido.

Quando todos os eletrodos tiverem sido colocados, cubra a circunferência dos eletrodos e das fibras ópticas com adesivo de cianoacrilato adicional e acelerador de cianoacrilato para evitar qualquer interrupção na ponteira do cabo óptico e do eletrodo nas zonas de conexão do fio condutor. Agora exponha os músculos do pescoço e insira os fios do eletrodo EMG sob o músculo. Ajuste o comprimento do eletrodo EMG para que ele se encaixe logo abaixo dos músculos da nuca e preencha os implantes com mais adesivo de cianoacrilato e acelerador.

Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de calor com monitoramento até a recompensa total. Para monitoramento de EEG / EMG durante a fotoexcitação de neurônios alvo, primeiro use um escalar para ajustar a intensidade do laser e use uma ponteira para amarrar a ponta do cabo do laser a uma fibra óptica não utilizada. Confirme se não há espaço na junção entre a fibra e o cabo.

Após 20 minutos, emita o laser aquecido para o verificador de intensidade e ajuste a intensidade para 10 miliwatts por milímetro quadrado. Defina a duração do pulso de luz para 10 milissegundos, o período de descanso para 40 milissegundos, o ciclo para 20 e a repetição para 20. Altere o modo do laser para a lógica do transistor e confirme se os pulsos de luz são emitidos da fibra controlada pelo regulador de padrão.

Conecte o eletrodo implantado e o adaptador de cabo e, em seguida, cubra a junção com material impermeável à luz para evitar vazamento de laser. E quando o laser estiver pronto, mova os camundongos para a câmara experimental para gravação de EEG / EMG. Para avaliar a latência para a vigília do sono sem movimento rápido dos olhos ou movimento rápido dos olhos, limite o tempo de gravação e o tempo de ganho do local otimizado e deixe os camundongos se moverem livremente na câmara experimental por pelo menos uma hora.

Durante o período experimental, monitore os sinais de EEG e EMG na mesma tela de gravação. Avalie o estado do mouse como vigília, sono sem movimento rápido dos olhos ou sono com movimento rápido dos olhos usando o controle de ganho para cada onda para facilitar a distinção de cada estado. Para medir a latência do sono sem movimento rápido dos olhos até a vigília, observe o sono estável sem movimento rápido dos olhos por 40 segundos, depois ligue o gerador de padrões para fotoestimulação e confirme a emissão do laser para as fibras ópticas implantadas.

Em seguida, registre os sinais de EEG / EMG até que o estado de sono mude para vigília.