JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:19 min • August 29th, 2025
Comece com um camundongo anestesiado com o crânio exposto.
O crânio apresenta uma craniotomia sobre o osso interparietal, à esquerda da linha média e caudal à sutura lambdoide, com a dura-máter removida para expor o cerebelo.
Aspire o cerebelo lateral esquerdo para revelar o núcleo coclear dorsal subjacente ou DCN, uma estrutura do tronco cerebral que contém neurônios que processam sinais auditivos.
Adicione solução salina para evitar a coagulação do sangue e limpar o fluido residual.
Posicione uma microsseringa contendo um vetor viral que codifica opsina, um canal iônico sensível à luz.
Abaixe a agulha no DCN.
Injetar a suspensão viral a uma taxa controlada e, em seguida, retirar a agulha.
Suture a incisão e permita que o camundongo se recupere.
O vírus injetado se liga aos receptores neuronais DCN e sofre endocitose.
Dentro do núcleo neuronal, o DNA viral desencadeia a expressão gênica, levando à produção de opsina.
O modelo está pronto para estimulação induzida por luz da via auditiva.
Use um tubo de sucção de cinco French para aspirar a porção mais lateral do cerebelo esquerdo, sobrejacente ao DCN. Para auxiliar na aspiração, ajuste o plano focal do microscópio na profundidade esperada do núcleo coclear para melhorar a visualização e garantir uma imagem nítida. Remova aproximadamente um quarto a um terço do cerebelo esquerdo.
O principal marco adjacente ao DCN é a ampola do canal semicircular superior. Após a aspiração, aparecerão mais sangramento, acúmulo de líquido cefalorraquidiano e deslocamento do cerebelo no DCN. Instilar solução salina rapidamente na craniotomia para evitar a coagulação do sangue. Use uma combinação de toques suaves com um ponto dentário e sucção para abrir caminho para visualização direta do DCN.
Depois que o DCN estiver claramente visível e livre de sangue e LCR, faça uma microinjeção de pressão do vetor nele com uma seringa Hamilton de cinco microlitros à prova de gás. Use uma agulha de calibre 34 com um chanfro raso para minimizar o trauma contuso e localizar o volume de injeção dentro do DCN. Em seguida, introduza lentamente a agulha com um micromanipulador até que a ponta não seja mais visível sob a superfície do DCN.
Comece a injetar 1,5 microlitros do vetor. Depois de concluído, retire lentamente a agulha, aproxime-se novamente da pele e permita que o mouse se recupere de acordo com o procedimento de recuperação padrão.