Regeneração axonal no nervo ciático de um camundongo após uma lesão por esmagamento

Comece com o nervo ciático isolado de um camundongo.

Os neurônios dentro do nervo foram transfectados para expressar proteínas citoplasmáticas fluorescentes.

O nervo foi esmagado para induzir uma lesão, que foi marcada com uma sutura.

Os segmentos de axônio lesionados no local degeneram e os macrófagos recrutados limpam os detritos.

As células de Schwann proliferam para formar trilhas orientadoras e secretam fatores neurotróficos que promovem o crescimento do axônio. Os axônios se estendem ao longo dessas trilhas, regenerando o nervo.

Fixe o nervo para preservar as estruturas celulares e, em seguida, remova todos os tecidos não neuronais aderidos.

Lave com um tampão para eliminar fixadores residuais.

Posicione o nervo em uma lâmina de microscópio, aplique um meio de montagem e coloque uma lamínula.

Achate o nervo para posicionar os axônios dentro do mesmo plano focal para imagens.

Usando um microscópio de epifluorescência, rastreie os axônios do local do esmagamento até suas extremidades distais para

medir o comprimento da regeneração.

Separe os DRGs junto com as raízes nervosas e o nervo ciático, cuidadosamente com microtesoura e microfórceps sob o microscópio de dissecação.

Em seguida, transfira o nervo ciático diretamente em PFA a 4% durante a noite a quatro graus Celsius. Para obter imagens e medir os axônios sensoriais marcados com fluorescência sob o microscópio de dissecação, retire cuidadosamente o tecido e a membrana anexados no nervo ciático fixo com microtesouras e micropinças. Em seguida, lave o nervo com PBS três vezes.

Em seguida, coloque o nervo ciático em uma lâmina e mantenha-o reto. Adicione 80 microlitros de solução anti-desbotamento ao redor do nervo e, em seguida, coloque uma lamínula sobre ele. Achate todo o tecido montado com pressão.

Em seguida, coloque o tecido achatado sob o microscópio epifluorescente invertido, equipado com um acessório para aquisição de mosaico e processamento de imagens. Ao medir o comprimento dos axônios regenerados, rastreie todos os axônios marcados com fluorescência identificáveis no nervo ciático, desde o local do esmagamento até as extremidades distais dos axônios.