JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:40 min • August 29th, 2025
Comece com o nervo ciático isolado de um camundongo.
Os neurônios dentro do nervo foram transfectados para expressar proteínas citoplasmáticas fluorescentes.
O nervo foi esmagado para induzir uma lesão, que foi marcada com uma sutura.
Os segmentos de axônio lesionados no local degeneram e os macrófagos recrutados limpam os detritos.
As células de Schwann proliferam para formar trilhas orientadoras e secretam fatores neurotróficos que promovem o crescimento do axônio. Os axônios se estendem ao longo dessas trilhas, regenerando o nervo.
Fixe o nervo para preservar as estruturas celulares e, em seguida, remova todos os tecidos não neuronais aderidos.
Lave com um tampão para eliminar fixadores residuais.
Posicione o nervo em uma lâmina de microscópio, aplique um meio de montagem e coloque uma lamínula.
Achate o nervo para posicionar os axônios dentro do mesmo plano focal para imagens.
Usando um microscópio de epifluorescência, rastreie os axônios do local do esmagamento até suas extremidades distais para
medir o comprimento da regeneração.
Separe os DRGs junto com as raízes nervosas e o nervo ciático, cuidadosamente com microtesoura e microfórceps sob o microscópio de dissecação.
Em seguida, transfira o nervo ciático diretamente em PFA a 4% durante a noite a quatro graus Celsius. Para obter imagens e medir os axônios sensoriais marcados com fluorescência sob o microscópio de dissecação, retire cuidadosamente o tecido e a membrana anexados no nervo ciático fixo com microtesouras e micropinças. Em seguida, lave o nervo com PBS três vezes.
Em seguida, coloque o nervo ciático em uma lâmina e mantenha-o reto. Adicione 80 microlitros de solução anti-desbotamento ao redor do nervo e, em seguida, coloque uma lamínula sobre ele. Achate todo o tecido montado com pressão.
Em seguida, coloque o tecido achatado sob o microscópio epifluorescente invertido, equipado com um acessório para aquisição de mosaico e processamento de imagens. Ao medir o comprimento dos axônios regenerados, rastreie todos os axônios marcados com fluorescência identificáveis no nervo ciático, desde o local do esmagamento até as extremidades distais dos axônios.