Transplante Estereotáxico de Suspensão de Células Neurais em um Camundongo com Lesão Cerebral Traumática

Comece com uma seringa pré-carregada conectada a uma bomba de seringa estereotáxica.

A seringa contém uma suspensão de células neurais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos.

Posicione a agulha acima do córtex cerebral exposto cirurgicamente de um camundongo com lesão cerebral traumática.

Abaixe a seringa para tocar a dura-máter com a ponta da agulha, ajuste as coordenadas para atingir o local da lesão e retraia ligeiramente. Agora,

crie uma pequena incisão, estabelecendo um ponto de entrada para a agulha.

Em seguida, abaixe o êmbolo para permitir o fluxo da suspensão da célula.

Abaixe a agulha e penetre no cérebro para alcançar a borda da substância cinzenta e da substância branca do córtex profundo.

Finalmente, infunda lentamente a suspensão celular enquanto irriga o local da cirurgia com solução salina para manter a hidratação.

Após a conclusão, retire a agulha, irrigue novamente e feche a incisão.

Com o tempo, as células transplantadas amadurecem, restauram os circuitos neurais e reparam danos cerebrais.

Aproximadamente 24 horas após a craniectomia, coloque o camundongo de volta no quadro estereotáxico.

Cubra o mouse com o campo cirúrgico fenestrado. Lave o local da incisão com solução salina estéril para limpar o local e soltar as suturas. Use um cotonete embebido em etanol a 70% para esterilizar suavemente o local da incisão e use uma pinça fina e uma tesoura oftálmica para remover as suturas.

Em seguida, irrigue o local da cirurgia e da craniectomia com solução salina estéril abundante. Em uma capa de biossegurança de cultura de células, gire suavemente ou bata no tubo de células para garantir uma suspensão celular homogênea. Use uma micropipeta para carregar aproximadamente 7,5 microlitros de células em uma seringa Hamilton através da extremidade do êmbolo.

Segurando a seringa em um ângulo de 120 graus com a extremidade do êmbolo voltada para baixo, insira o êmbolo tomando cuidado para não introduzir uma bolha de ar entre a suspensão e a ponta do êmbolo. Encaixe o conjunto da junta na agulha da pipeta e encaixe a agulha na seringa. Empurre o êmbolo para mover a suspensão celular para dentro da agulha da pipeta e encaixe a seringa na bomba de seringa estereotáxica.

Avance o êmbolo para certificar-se de que o conjunto da bomba da seringa está funcionando corretamente e mova a agulha para as coordenadas da injeção. Alinhe a ponta da agulha com bregma e defina as coordenadas x e y como zero. Mova a ponta da agulha sobre a craniectomia para dois milímetros laterais e menos um milímetro posterior ao bregma e toque a ponta da agulha na superfície da dura-máter.

Levante ligeiramente a agulha e faça uma pequena incisão na dura-máter no local onde a agulha fez contato. Defina a coordenada estereotáxica para z igual a zero e empurre o êmbolo para confirmar que a suspensão celular está fluindo adequadamente antes de introduzir a agulha no cérebro. Introduza a agulha no cérebro a uma profundidade de z igual a menos 1,4 milímetros para colocar o enxerto na borda da substância cinzenta / substância branca do córtex profundo.

Ligue a bomba de seringa para infundir a suspensão celular durante um período de 15 minutos. Use um microscópio de longa distância de trabalho para monitorar o fluxo de saída da suspensão celular, irrigando o local da cirurgia com solução salina estéril durante a injeção para manter a hidratação do tecido. Quando todas as células tiverem sido entregues, retire lentamente a agulha de transplante e irrigue o local da cirurgia com solução salina adicional antes de fechar a incisão com novas suturas.

Em seguida, preste cuidados pós-operatórios conforme demonstrado.