Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:50 min. • August 29th, 2025
Descongele as células progenitoras neurais ou NPCs armazenadas com um crioprotetor em um bloco de calor.
Esses NPCs expressam aumento da alfa-sinucleína, um fator chave na doença de Parkinson.
Transfira as células descongeladas para um tubo contendo meio basal quente para diluir o crioprotetor.
Centrifugue para pellet as células, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio neural.
Adicione a suspensão celular a uma placa multipoços revestida com ECM e incube para permitir a adesão e proliferação celular.
Adicione vetores lentivirais contendo RNA guia, Cas9-DNA metiltransferase desativada e um gene de resistência a antibióticos.
Incubar para facilitar a entrada viral, transcrição reversa do RNA viral, integração no genoma do hospedeiro e expressão do transgene.
O RNA guia direciona dCas9 para o gene da alfa-sinucleína, onde a metilação do DNA mediada pela metiltransferase reduz a expressão da alfa-sinucleína.
Substitua o meio por meios neurais contendo antibióticos para selecionar as células transduzidas, enquanto as células não transduzidas sofrem apoptose.
Coloque um Cryovial com MD NPC em um bloco de calor de 37 graus Celsius por dois minutos e transfira as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mililitros com 10 mililitros de DMEM-F12 quente.
Centrifugar a 300 g durante cinco minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em dois mililitros de meio N2B2 completo pré-aquecido. Adicione dois mililitros de N2B27 à suspensão de células e coloque dois mililitros de células em cada poço da placa de seis poços revestida com BMM previamente preparada.
Incube as células a 37 graus Celsius com 5% CO_2 durante a noite. Quando os NPCs MD estiverem em 70% de confluência, transduza-os adicionando dois microlitros de vetores de RNA guia de lentivírus d-Cas9-DNMT3A e gire suavemente a placa. Depois de incubar as células nas mesmas condições de anteriormente por 16 horas, substitua o meio N2B27 48 horas após a transdução.
Adicionar N2B27 com cinco microgramas por mililitro de puromicina