Transdução lentiviral de células progenitoras neurais para regulação epigenética da expressão de alfa-sinucleína

Descongele as células progenitoras neurais ou NPCs armazenadas com um crioprotetor em um bloco de calor.

Esses NPCs expressam aumento da alfa-sinucleína, um fator chave na doença de Parkinson.

Transfira as células descongeladas para um tubo contendo meio basal quente para diluir o crioprotetor.

Centrifugue para pellet as células, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio neural.

Adicione a suspensão celular a uma placa multipoços revestida com ECM e incube para permitir a adesão e proliferação celular.

Adicione vetores lentivirais contendo RNA guia, Cas9-DNA metiltransferase desativada e um gene de resistência a antibióticos.

Incubar para facilitar a entrada viral, transcrição reversa do RNA viral, integração no genoma do hospedeiro e expressão do transgene.

O RNA guia direciona dCas9 para o gene da alfa-sinucleína, onde a metilação do DNA mediada pela metiltransferase reduz a expressão da alfa-sinucleína.

Substitua o meio por meios neurais contendo antibióticos para selecionar as células transduzidas, enquanto as células não transduzidas sofrem apoptose.

Coloque um Cryovial com MD NPC em um bloco de calor de 37 graus Celsius por dois minutos e transfira as células descongeladas