Injeção de células progenitoras neurais fluorescentes em organoides cerebrais humanos para modelagem de transplante

Comece com células progenitoras neurais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas marcadas com fluorescência ou NPCs.

Ressuspenda as células em um hidrogel de matriz extracelular para criar uma mistura uniforme de matriz celular.

Incube a mistura no gelo.

Em seguida, transfira um organoide cerebral humano para um prato.

Remova o excesso de mídia e coloque o prato sob um microscópio para o procedimento de injeção.

Dispense a mistura célula-matriz em uma lâmina de vidro estéril pré-resfriada e aspire-a usando uma seringa pré-resfriada.

Injete lentamente a mistura na superfície do organoide para minimizar a ruptura do tecido.

Deixe o organoide descansar brevemente, adicione meio, transfira o organoide para uma placa de vários poços e incuba.

O hidrogel solidifica, ancorando os NPCs no local da injeção. Rastreie os NPCs usando microscopia de fluorescência.

Com o tempo, os NPCs proliferam e migram para regiões distantes do organoide, onde se diferenciam em neurônios imaturos e maduros.

Isso permite um transplante celular confiável com interrupção mínima de organoides, adequado para terapia com células neurais.

Comece removendo a suspensão unicelular de células-tronco pluripotentes induzidas ou células progenitoras neurais derivadas de iPSC, ou NPCs, do gelo e centrifugando-as a 300g por cinco minutos a 4 graus Celsius.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 3 miligramas por mililitro de matriz de membrana basal solubilizada para obter um volume final de dois microlitros por injeção. Coloque imediatamente a suspensão de volta no gelo até o uso. Transfira a seringa pré-resfriada do freezer de 20 graus Celsius para um balde de gelo para uso posterior.

Em seguida, remova a placa organoide cerebral da incubadora e transfira o organoide para uma placa de 35 milímetros usando uma ponta larga. Para estabilizar os organoides e facilitar a injeção, remova o meio o máximo possível sem danificar o organoide. Coloque o prato de 35 milímetros contendo o organoide sob um microscópio de dissecação para facilitar a injeção.

Quando os organoides estiverem prontos para injetar, ressuspenda suavemente as células NPC marcadas com EGFP usando uma ponta de pipeta P20 resfriada e mova dois microlitros dessas células para uma lâmina de vidro estéril pré-resfriada. Pegue uma seringa de insulina pré-cheia do gelo e retire lentamente os 2 microlitros de suspensão celular com o chanfro da agulha voltado para baixo. Abra a tampa do prato que contém o organoide antes de focar o microscópio nele.

Segure o prato com uma mão, coloque o chanfro da agulha para cima. E com a outra mão, injete a célula lentamente na superfície do organoide. Depois de injetar as células, coloque a tampa de volta no prato e incube o organoide injetado por um a dois minutos.

Em seguida, adicione suavemente 500 microlitros do meio organoide à placa antes de transferir o organoide para uma placa de 24 poços com uma ponta de furo largo. Incube o organoide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com uma troca completa de meio a cada dois dias.