Name: Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a decelularização e recelularização de fígados inteiros para engenharia de órgãos usando hepatócitos primários de ratos. Este método preserva a matriz extracelular e a arquitetura vascular, permitindo a criação de enxertos funcionais para transplante.

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Os autores gostariam de agradecer a Jack Milwid para o desenho da câmara de perfusão in vitro. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH dos EUA, R01DK59766 e R01DK084053 para MY, R00DK080942 para KU, EUA NSF CBET-0853569 para KU e os Hospitais Shriners para Crianças, a BEU (concessão não. 8503). Reconhecemos também o apoio e os Hospitais Shriners para Crianças.

1. Decelularização fígado <ol><li> Colheita de um fígado de ratos com canulação da veia porta utilizando e 18 de calibre do cateter. Deixe o inferior e veia cava superior aberta. Manter o órgão hidratado em tampão fosfato salino (PBS) numa placa de Petri de 10 cm. </li><li> Criação de um sistema de perfusão, que consiste em reservatório de 8 litros, bomba peristáltica e um borbulhador. </li><li> Preencher o sistema de perfusão com tampão fosfato e mantê-lo funcionando por 10 minutos. Preencha PBS em uma placa de Petri de 10 cm e reduzir a taxa de fluxo de tampão fosfato salino a 1 mL / min. </li><li> Transferir cuidadosamente o fígado colhidas ao tampão fosfato salina preenchidos de 10 cm placa de Petri. </li><li> Continue com perfusão PBS durante a noite. </li><li> Iniciar a perfusão com 0,01% (w / v) dodecil sulfato de sódio (SDS) em água destilada por 5 minutos. </li><li> Perfundir com PBS por 1 hora. </li><li> Repita os passos 1.6 e 1.7 mais três vezes o aumento do tempo de perfusão SDS para minutos 10, 15 e 20 em cada tempo. </li><li> Continue a perfusão com 0,01% (w / v) SDS por 24 horas. </li><li> Continue a perfusão com 0,1% (w / v) SDS por 24 horas. </li><li> Perfundir com 0,2% (w / v) SDS por 3 horas. </li><li> Perfundir com 0,5% (w / v) SDS por 3 horas. </li><li> Perfundir com água destilada por 15 minutos. </li><li> Perfundir com 1% (w / v) de Triton X-100 em água destilada por 30 minutos para remover qualquer ácidos nucléicos ligado. </li><li> Para lavar o fígado decelularizado matriz (DLM), perfundir com PBS por 2 horas. </li><li> Opcional: ressecar todos os lobos, exceto o lobo mediano. </li><li> Armazenar o DLM numa placa de Petri limpa e selada embebido em PBS a 4 ° C até que esteja pronto para uso (Figura 1). </li><li> Para esterilizar o DLM: 1) Lave o DLM com PBS estéril contendo 0,1% (v / v) de ácido peracético e 4% (v / v) de etanol e incubar durante 3 horas a 4 o C. 2) Lavar com PBS esterilizado duas vezes. 3) Lavar com PBS estéril contendo 2% de penicilina-estreptomicina, 10ug / mL de gentamicina e 2,5 ug / ml anfotericina B. loja o fígado decelularizado na mesma solução a 4 ° C até ser utilizado para experimentos recellularization. </li></ol> 2. Recellularization de decelularizados Fígado Matrix <ol><li> Criação de um sistema de perfusão, que consiste de uma câmara de perfusão, bomba peristáltica e um borbulhador em condições estéreis. Preencher o sistema de perfusão com 200 mL de meio de cultura, por exemplo, alta de glicose DMEM (Sigma), 10% soro fetal bovino (Hyclone), 100 U mL -1 de penicilina e 100 mg mL -1 de estreptomicina (Invitrogen). </li><li> Coloque a matriz fígado decelularizado na câmara de perfusão e conectar o DLM ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta, enquanto a bomba está funcionando em 5 mL / min para evitar a formação de bolhas de ar. </li><li> Permitir a perfusão do meio através da DLM por 30 minutos. </li><li> Isolar hepatócitos primários de um rato adulto com viabilidade, pelo menos, 90%. </li><li> Interromper o fluxo no sistema de perfusão e injecte lentamente 50000000 hepatócitos (em mL 1-3 de meio de cultura) em sistema de perfusão através do borbulhador. </li><li> Iniciar o fluxo de 10 mL / min e recircular o meio por 10 minutos. </li><li> Repita os passos 2.5 e 2.6, até um total de 200 milhões de células são introduzidas no DLM (Figura 2) 6. </li><li> Uma vez que todas as células são perfundidos para a DLM, coletar o perfusato em quatro tubos de 50 ml de centrífuga e centrifugar a 600 rpm por 10 minutos. Descartar o sobrenadante e recolher as bolinhas em um único tubo. Determinar o número de células e viabilidade através de exclusão do azul tripan para determinar a eficiência da semeadura. </li></ol> 3. Cultivo in vitro do Enxerto Fígado Recellularized <ol><li> Criação de um sistema de perfusão, que consiste de uma câmara de perfusão, bomba peristáltica, oxigenador e um borbulhador em condições estéreis (Figura 3). Preencher o sistema de perfusão com 50 mL de meio de cultura, por exemplo, E Williams (Sigma), 5% soro fetal bovino (Hyclone), 0,5 mL de insulina U -1 (Eli Lilly), 20 ng mL -1 EGF (Invitrogen) , 14 ng mL -1 glucagon (Bedford Laboratories), 7,5 mg mL -1 hidrocortisona (Pharmacia), 100 U mL -1 de penicilina e estreptomicina 100 mg mL -1 (Invitrogen). </li><li> Coloque o enxerto de fígado recellularized na câmara de perfusão e conectar o DLM ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta, enquanto a bomba está funcionando em 5 mL / min para evitar a formação de bolhas de ar. </li><li> Assepticamente fechar a câmara de perfusão e lacre firmemente para evitar qualquer vazamento durante a cultura. </li><li> Transferir o sistema de perfusão de uma incubadora que é de 37 º C e tem 10% de CO 2 e aumentar a taxa de fluxo de perfusão a 15 mL / min. </li><li> Conecte o oxigenador a um 95% O 2 e 5% CO 2 tanque de mistura de gás e definir a taxa de fluxo de gás para 0,5 litros / min. Isto deve atingir uma pressão parcial de oxigênio de aproximaçãotely mmHg 400. </li><li> A cultura pode continuar até 10 dias, com variações diárias de meio de cultura. O meio de cultura podem ser amostrados diariamente para monitoramento das funções hepática do enxerto, tais como uréia, albumina e secreção de ácido total de bile. No final do período de cultura, o enxerto de fígado recellularized podem ser amostrados para análise molecular e histológica. </li></ol> 4. Resultados representativos: A decelularização completa de um fígado de rato leva cerca de 72 horas usando o protocolo descrito. A matriz resultante mantém 100% do colágeno fibrilar, 50% dos glicosaminoglicanos e apenas 5% do DNA do fígado nativo (Tabela 1) 6. A estrutura vascular da matriz é preservada como evidenciado pela corrosão de fundição e digitalização análise de microscopia eletrônica (Figura 4) 6. A presença da microarquitetura vascular dentro da DLM facilita o seu repovoamento com células com uma eficiência de 96% e sua subseqüente perfusão de cultura in vitro. O enxerto de fígado recellularized podem ser cultivadas até 10 dias in vitro e exibe as funções do fígado adequada como foi confirmado através de uréia, albumina e secreção de bile ácida total (Figura 5) 6. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Decelularizados matriz de fígado no final do processo de decelularização. (A) todo o fígado (b) a mediana do lobo após a ressecção. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representação esquemática do recellularization da DLM. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Perfusão configuração do sistema para a cultura in vitro do enxerto hepático recellularized. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. A estrutura microvascular é retida na matriz do fígado descelularizados. Corrosão imagens elenco de a) b) um fígado decelularizado um fígado normal, portal (vermelho) e venosa vasculatura (azul). Digitalização de imagens de microscopia eletrônica do c DLM) um navio, d) apresentando uma seção do ducto biliar, como pequenos vasos (setas), barras de escala (a, b) 5 mm (c, d) 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Liver funções específicas do enxerto hepático recellularized durante o cultivo in vitro de perfusão. uma secreção) de albumina (p = 0,5249), b) produção de uréia (p = 0,5271) e c) a secreção de bile ácida total (p = 0,0114). Análise estatística da diferença entre a experiência eo controle foi feito durante o período de 10 d cultura pelo teste de Friedman em a = 0,01. Barras de erro representam sem (n = 3). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Livera fresco </td><td> Decelularizado fígado uma matriz </td><td rowspan="2"> p-valores </td><td rowspan="2"> % De fígado fresco </td></tr><tr><td></td><td> n = 4 </td><td> n = 8 </td></tr><tr><td> Colágeno </td><td rowspan="2"> 0,07 ± 0,01 </td><td rowspan="2"> 0,08 ± 0,03 </td><td rowspan="2"> 0,56 </td><td rowspan="2"> 114% </td></tr><tr><td> (Mg por fígado g) </td></tr><tr><td> Glicosaminoglicanos </td><td rowspan="2"> 73,1 ± 6,7 </td><td rowspan="2"> 34,2 ± 2,9 </td><td rowspan="2"> 0,004 </td><td rowspan="2"> 47% </td></tr><tr><td> (Mg por fígado g) </td></tr><tr><td> DNA </td><td rowspan="2"> 14,9 ± 5,6 </td><td rowspan="2"> 0,44 ± 0,08 </td><td rowspan="2"> 3.3 10 -5 </td><td rowspan="2"> 2,9% </td></tr><tr><td> (Mg por fígado g) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. A composição bioquímica da matriz fígado decelularizado em comparação com o fígado nativo. uma Os valores são representados como média ± epm

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui decelularização perfusão produz um todo fígado andaime que tem a mesma estrutura bruta ea microarquitetura vascular do fígado nativo. O andaime tem uma composição da matriz extracelular semelhante ao fígado nativo. O método recellularization atinge repovoamento do andaime com células de alta eficiência e as células permanecem viáveis ​​e funcionais durante o período de cultivo in vitro testados. Com a adição de células não parenquimatosos para o enxerto de fígado recellularized, prevemos ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=2394">Decellularization and Recellularization of Whole Livers</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>Dodecilsulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Motor digital Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Cabeçote padrão de bomba Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>Trampa de bolhas</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

decelularização e recellularization de fígados inteiros

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

O fígado é um órgão complexo que requer constante de perfusão para a entrega de nutrientes e oxigênio e remoção de resíduos, a fim de sobreviver 1. Esforços para recriar ou imitar a microestrutura fígado com motivos de abordagem utilizando a engenharia de tecidos e técnicas de microfabricação não tenham sido bem sucedida até agora devido a este desafio do projeto. Além disso, biomateriais sintéticos usados ​​para criar andaimes para aplicações de engenharia de tecidos do fígado têm sido limitados em induzir a regeneração dos tecidos e reparação, em grande parte devido à falta de motivos de células específicas de ligação que induziria as funções das células adequada 2. Tecidos decelularizados nativa vasos sanguíneos, tais 3 e 4 de pele, por outro lado têm encontrado muitas aplicações na engenharia de tecidos, e forneceram uma solução prática para alguns dos desafios. A vantagem de decelularizado matriz nativa é que ele mantém, até certo ponto, a composição original, a microestrutura e, conseqüentemente aumentando adesão celular ea reorganização 5. Neste trabalho, descrever os métodos para realizar a perfusão decelularização do fígado, de tal forma que um fígado intacto bioscaffold que mantém a estrutura dos principais vasos sanguíneos é obtido. Além disso, descrevemos métodos para recellularize esses bioscaffolds com adultos hepatócitos primários, a criação de um enxerto de fígado que é funcional in vitro, e tem o acesso dos navios necessários para o transplante em vivo.

Decelularização perfusão é uma nova técnica para produzir scaffolds fígado inteiro que mantém a composição do órgão matriz extracelular e microarquitetura. Aqui, o método de preparação de andaimes órgão inteiro usando decelularização perfusão e repovoamento posterior com hepatócitos é descrito. Enxertos de fígado para transplante funcional e pode ser gerado usando esta técnica.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

O fígado é um órgão complexo que requer perfusão constante para o fornecimento de nutrientes e oxigênio e a remoção de resíduos para sobreviver1. Esforços para...

O objetivo geral deste procedimento é preparar enxertos hepáticos recellularizados utilizando matriz hepática descelularizada. Isso é realizado primeiramente por meio da cânulação de um fígado doador. O órgão é então descelularizado por perfusão com uma série de soluções detergentes.A revascularização da matriz hepática descelularizada é então realizada mediante a introdução de hepatócitos primários adultos por perfusão. Por fim, utiliza-se um sistema de perfusão in vitro para cultivar o enxerto hepático celularizado. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram a função hepática dos enxertos redimensionados in vitro por meio da medição da secreção de albumina, ureia e ácidos biliares totais no meio de perfusão.A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a fabricação de suportes utilizando biomateriais sintéticos e técnicas tradicionais de engenharia de tecidos, é, na minha opinião, a presença da composição da matriz extracelular específica do tecido. O suporte descelularizado por perfusão também possui a microarquitetura específica do tecido, como a estrutura vascular. A presença da estrutura vascular nos permite reintroduzir as c

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Bioengineering

Bioengenharia

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