Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

O objetivo geral deste procedimento é preparar enxertos hepáticos recellularizados utilizando matriz hepática descelularizada. Isso é realizado primeiramente por meio da cânulação de um fígado doador. O órgão é então descelularizado por perfusão com uma série de soluções detergentes.

A revascularização da matriz hepática descelularizada é então realizada mediante a introdução de hepatócitos primários adultos por perfusão. Por fim, utiliza-se um sistema de perfusão in vitro para cultivar o enxerto hepático celularizado. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram a função hepática dos enxertos redimensionados in vitro por meio da medição da secreção de albumina, ureia e ácidos biliares totais no meio de perfusão.

A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a fabricação de suportes utilizando biomateriais sintéticos e técnicas tradicionais de engenharia de tecidos, é, na minha opinião, a presença da composição da matriz extracelular específica do tecido. O suporte descelularizado por perfusão também possui a microarquitetura específica do tecido, como a estrutura vascular. A presença da estrutura vascular nos permite reintroduzir as células no suporte de maneira mais uniforme.

Ele também nos permite perfundir uniformemente com nutrientes para melhorar a sobrevivência celular. A parte de desaceleração do protocolo será demonstrada por Nima, juntamente com o pesquisador pós-doutorando em nosso laboratório. A parte de retarifação será demonstrada por Gabriel Price, que também é pesquisador pós-doutorando.

Seu trabalho concentra-se na industrialização desses enxertos. Para realizar a descelularização por perfusão, comece colhendo um fígado de rato por meio da cânula da veia porta. Utilizando um cateter de 18 gauge, mantenha a veia cava inferior e a veia cava superior abertas. Mantenha o órgão hidratado em solução salina tamponada com fosfato ou PBS em uma placa de Petri de 10 centímetros.

Em seguida, monte um sistema de perfusão composto por um reservatório de oito litros, uma bomba peristáltica e um captador de bolhas. Preencha o sistema de perfusão com solução salina tamponada com fosfato ou PBS e mantenha-o em funcionamento por 10 minutos. Em seguida, preencha uma placa de Petri de 10 centímetros com PBS e reduza a taxa de fluxo do tampão para 1,2 mililitro por minuto.

Transfira cuidadosamente o fígado colhido para a placa de Petri contendo PBS e deixe-o perfundir durante a noite. No dia seguinte, perfunda o fígado com 0,01% de sulfato de ESAL de sódio ou SDS em água destilada por cinco minutos.

Em seguida, retorne ao PBS por uma hora. Repita os passos de perfusão com SDS e PBS mais três vezes, aumentando o tempo de perfusão com SDS para 10, 15 e, finalmente, 20 minutos. Em seguida, realize a perfusão do fígado com a seguinte série: 0,01% SDS por 24 horas.

0,1% SDS por 24 horas. 0,2% SDS por três horas, 0,5% SDS por três horas. Água destilada por 15 minutos, 1% Triton X 100 em água destilada por 30 minutos, o que removerá quaisquer ácidos nucleicos ligados.

E, finalmente, PBS por duas horas, o que irá lavar a matriz hepática descelularizada ou DLM após a conclusão da perfusão, se desejado, resseque todos os lobos exceto o lobo mediano. Armazene a DLM em uma placa de Petri limpa e selada em PBS a quatro graus Celsius até o momento do uso para esterilizar a DLM. Passe uma lavagem com PBS estéril contendo 0,1% de ácido peracético e 4% de etanol e incube por três horas a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave o MFG duas vezes com PBS estéril. Depois, com PBS contendo 2% de penicilina-estreptomicina, 10 microgramas por mililitro de gentamicina e 2,5 microgramas por mililitro de anfotericina B. Armazene o fígado descelularizado na mesma solução a quatro graus Celsius até o momento de utilização em experimentos de semeadura.

Dois, celularizar uma matriz hepática descelularizada sob uma cabine de cultura de tecidos. Comece com um sistema de perfusão semelhante ao utilizado para descelularizar o fígado. Encha o sistema de perfusão com 200 mililitros de meio de cultura, como DMEM com alta concentração de glicose, 10% de soro bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina e 100 microgramas por mililitro de estreptomicina.

Coloque o DLM na câmara de perfusão e conecte-o ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta enquanto a bomba estiver funcionando a cinco mililitros por minuto. Para evitar a formação de bolhas de ar, permita que o meio perfunda o DLM por 30 minutos. Em seguida, interrompa o fluxo no sistema de perfusão e injete lentamente 50 milhões de hepatócitos isolados de uma rata adulta no sistema de perfusão através do captador de bolhas.

Reinicie o fluxo em 10 mililitros por minuto e recircule o meio por 10 minutos. Interrompa novamente o fluxo do meio. Injete um adicional de 50 milhões de hepatócitos.

Em seguida, reinicie o fluxo novamente a 10 mililitros por minuto. Repita este procedimento até que um total de 200 milhões de hepatócitos tenha sido introduzido no DLM. Uma vez que todas as células tenham sido injetadas no DLM, colete o efluente em tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a 800 RPM durante cinco minutos.

Descarte os sobrenadantes e combine os pellets em um único tubo. Determine o número de células e sua viabilidade por exclusão com azul de tripano. Para estabelecer a eficiência de semeadura em cultura.

Um enxerto hepático celularizado. Monte um sistema de perfusão estéril que inclua um oxigenador. Preencha o sistema de perfusão com 50 mililitros de meio de cultura, como Williams E com 5% PBS, 0,5 unidades por mililitro de insulina.

20 nanogramas por mililitro de EGF, 14 nanogramas por mililitro de glucagona, 7,5 microgramas por mililitro de hidrocortisona, 100 unidades por mililitro de penicilina e 100 microgramas por mililitro de estreptomicina. Coloque o enxerto hepático celularizado na câmara de perfusão e conecte-o ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta enquanto a bomba estiver funcionando a cinco mililitros por minuto.

Para evitar a formação de bolhas de ar, feche assépticamente a câmara de perfusão e vede-a firmemente para evitar qualquer vazamento durante o cultivo. Incube o sistema de perfusão a 37 graus Celsius com 10% de dióxido de carbono e aumente a taxa de fluxo de perfusão para 15 mililitros por minuto. Conecte o oxigenador a um tanque com mistura gasosa de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono e ajuste a taxa de fluxo de gás para 0,5 litros por minuto.

Isso deve atingir uma pressão parcial de oxigênio de aproximadamente 400 milímetros de mercúrio. Continue o cultivo por até 10 dias com trocas diárias do meio de cultura. Colete amostras do meio diariamente para albumina, ureia e secreção de ácidos biliares totais, a fim de monitorar as funções hepáticas do enxerto ao final do período de cultivo.

Colete o enxerto hepático celularizado para análise molecular e histológica. A descelularização completa de um fígado de rato leva cerca de 72 horas, utilizando o protocolo descrito.

A matriz resultante retém 100% do colágeno fibrilar, 50% dos glicoaminoglicanos e apenas 5% do DNA do fígado nativo. A estrutura vascular da matriz é preservada, conforme evidenciado por análises de moldagem por corrosão e microscopia eletrônica de varredura. A presença da microarquitetura vascular dentro da DLM facilita sua repovoamento com células com uma eficiência de 96% e sua subsequente perfusão.

Para cultura in vitro, o enxerto hepático pode ser cultivado por até 10 dias in vitro e exibe funções hepáticas adequadas, conforme confirmado pela secreção de albumina, ureia e ácidos biliares totais. Assim, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como descelularizar e recelularizar todo o fígado.