Separação de Frações de Membrana Interna e Externa de Bactérias Gram-Negativas

Comece com a fração total da membrana de uma bactéria Gram-negativa, incluindo vesículas de membrana interna e externa, suspensa em uma sacarose de baixa densidade que preserva a integridade estrutural.

Para separar as vesículas de membrana, adicione sequencialmente soluções de sacarose de alta e média densidade em um tubo de ultracentrífuga.

Em seguida, adicione a fração de membrana e a sacarose de baixa densidade para criar um gradiente de sacarose descontínuo.

Ultracentrífuga para separar vesículas com base em suas densidades.

As vesículas de membrana interna menos densas formam uma camada no topo.

As vesículas de membrana externa mais densas, ricas em lipopolissacarídeos e proteínas, formam uma banda na interface de soluções de sacarose de média e alta densidade.

Recolha a camada interna da membrana e descarte a solução gradiente, deixando uma pequena quantidade.

Em seguida, colete a camada externa da membrana.

Adicione um buffer de armazenamento a cada fração para estabilização.

Centrifugue para separar as vesículas e remover o sobrenadante.

Ressuspenda as vesículas de membrana purificadas, homogeneize e armazene-as em baixas temperaturas para análise posterior.

Para preparar o gradiente