Um ensaio para a quantificação de polifosfato inorgânico em bactérias
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:16 min. • August 29th, 2025
O polifosfato inorgânico (polyP) é um polímero de fosfato linear envolvido na virulência bacteriana e na resposta ao estresse, armazenado como grânulos citoplasmáticos.
Para quantificar o poliP, pegue uma placa multipoços com concentrações crescentes de padrões de fosfato inorgânico.
Adicione o extrato de poli P bacteriano purificado a um poço vazio.
Introduzir um tampão de reação contendo a enzima exopolifosfatase em cada poço e incubar.
A enzima cliva o poliP em fosfato inorgânico livre, convertendo-o em uma forma quantificável.
Adicionar um reagente de detecção contendo molibdato e ácido ascórbico e incubar.
O molibdato reage com o fosfato para formar complexos de fosfomolibdato, que são reduzidos pelo ácido ascórbico em complexos de cor azul.
Meça a absorbância do complexo colorido. A absorbância medida corresponde à intensidade da cor azul, que é diretamente proporcional à concentração de fosfato.
Gere a curva padrão e calcule os níveis de fosfato da amostra, refletindo o conteúdo original de poliP da bactéria.
Comece preparando padrões contendo fosfato de potássio zero, cinco, 50 ou 200 micromolares em pH 50 milimolar oito tris-cloridrato.
Alíquota de 100 microlitros de cada padrão de
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