Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:16 min. • August 29th, 2025
O polifosfato inorgânico (polyP) é um polímero de fosfato linear envolvido na virulência bacteriana e na resposta ao estresse, armazenado como grânulos citoplasmáticos.
Para quantificar o poliP, pegue uma placa multipoços com concentrações crescentes de padrões de fosfato inorgânico.
Adicione o extrato de poli P bacteriano purificado a um poço vazio.
Introduzir um tampão de reação contendo a enzima exopolifosfatase em cada poço e incubar.
A enzima cliva o poliP em fosfato inorgânico livre, convertendo-o em uma forma quantificável.
Adicionar um reagente de detecção contendo molibdato e ácido ascórbico e incubar.
O molibdato reage com o fosfato para formar complexos de fosfomolibdato, que são reduzidos pelo ácido ascórbico em complexos de cor azul.
Meça a absorbância do complexo colorido. A absorbância medida corresponde à intensidade da cor azul, que é diretamente proporcional à concentração de fosfato.
Gere a curva padrão e calcule os níveis de fosfato da amostra, refletindo o conteúdo original de poliP da bactéria.
Comece preparando padrões contendo fosfato de potássio zero, cinco, 50 ou 200 micromolares em pH 50 milimolar oito tris-cloridrato.
Alíquota de 100 microlitros de cada padrão de fosfato e 100 microlitros de amostras de poliP extraídas em poços separados de uma placa transparente de 96 poços. Prepare uma mistura master contendo, por amostra, 30 microlitros de tampão de reação 5X ScPPX, 19 microlitros de água e um microlitro de ScPPX purificado. Adicione 50 microlitros da mistura master a cada poço da placa de 96 poços.
E incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. No dia da detecção, prepare um novo estoque de trabalho de solução de detecção misturando a 9,12 mililitros de base de solução de detecção com 88 mililitros de ácido ascórbico molar e deixe-o atingir a temperatura ambiente antes de usar. Adicione 50 microlitros de solução de detecção a cada amostra e padrões na placa de 96 poços.
Para permitir o desenvolvimento da cor, incube a placa em temperatura ambiente por aproximadamente dois minutos. Use um leitor de placas para medir a absorbância em 882 nanômetros e calcular a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão de fosfato de potássio. Em seguida, converta as concentrações de fosfato em nanomoles de fosfato derivado de poliP em cada lisado celular e normalize o conteúdo de poliP celular em proteína celular total, conforme descrito no manuscrito.