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Microbiologia
0 vistas • 2:30 min • August 29th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo macrófagos pré-tratados expostos a vesículas bacterianas da membrana externa de Legionella pneumophila, ou OMVs.
Adicione Legionella pneumophila em uma proporção definida de bactéria para célula hospedeira para infectar os macrófagos tratados com OMV.
Durante a incubação, os macrófagos internalizam as bactérias dentro de fagossomos ligados à membrana.
O pré-tratamento com OMV altera a sinalização dos macrófagos, inibindo a maturação dos fagossomos.
Isso facilita a formação de um vacúolo contendo Legionella, que protege a bactéria e permite a replicação intracelular.
Adicione um detergente e incube para lisar os macrófagos. Isso libera as bactérias intracelulares no meio.
Listre o lisado diluído em uma placa de ágar enriquecida com nutrientes.
Durante a incubação, as bactérias crescem e formam colônias visíveis.
Conte as colônias para determinar as unidades formadoras de colônias, ou UFCs, que representam o número de bactérias viáveis.
Compare as contagens de UFC entre macrófagos tratados com OMV e não tratados.
Uma UFC mais alta em macrófagos tratados com OMV em comparação com macrófagos não tratados indica que os OMVs facilitam a sobrevivência de Legionella dentro dos macrófagos.
Para infectar células THP-1 pré-tratadas ou não tratadas com núcleo B da cepa L. pneumophila do tipo selvagem ou células murinas BMDM com um mutante sem flagelos dessa cepa sem alterar o meio das células.
Adicione bactérias a um MOI de 0,5, o que equivale a uma vezes 10 elevado ao quinto L. pneumophila por poço. Incubar as culturas por 24 e 48 horas, respectivamente. Para lisar as células, adicione saponina a uma concentração final de 0,1% e incube as células por cinco minutos.
Em seguida, listre 50 microlitros das diluições necessárias em placas de ágar BCYE e incube as placas por três dias.
Conte visualmente as colônias formadas a olho nu e faça cálculos de acordo com o protocolo de texto.