JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:12 min • August 29th, 2025
Faça uma cultura de Staphylococcus aureus, uma bactéria com uma parede celular espessa de peptidoglicano.
Dilua a cultura em meio fresco contendo antibióticos e incube-a a uma temperatura quente com agitação para promover o crescimento bacteriano.
Transfira a cultura para um tubo e centrifugue-a para pellet as bactérias.
Descarte o sobrenadante e coloque o pellet no gelo para proteger as bactérias de danos.
Ressuspenda o pellet em tampão de lise e transfira-o para um tubo contendo esferas de sílica.
Insira o tubo em um instrumento mecânico de lise celular e inicie a agitação.
Colisões rápidas entre as bactérias e os grânulos geram forças de cisalhamento. Isso lisa as bactérias, liberando DNA, RNA e complexos RNA-proteína.
Os íons no tampão de lise estabilizam as estruturas do RNA, enquanto os agentes redutores no tampão inativam as enzimas degradadoras do RNA.
Agora, centrifugue a mistura novamente para pellet os detritos.
Colete o sobrenadante contendo ácidos nucléicos e proteínas para análise posterior.
Cultive uma colônia de cepas carregando plasmídeos pCN51 P3 MS2 sRNA ou pCN51 P3 MS2 em três mililitros de meio BHI suplementado com 10 microgramas por microlitro de eritromicina em duplicatas.
Diluir cada cultura durante a noite em 50 mililitros de meio BHI fresco suplementado com eritromicina para atingir uma DO 600 de 0,05. Cultive as culturas a 37 graus Celsius com agitação a 180 RPM por seis horas. Transfira cada cultura para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue os tubos a 2.900 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius, depois descarte o sobrenadante, congele e armazene-os a menos 80 graus Celsius ou mantenha os pellets no gelo e execute diretamente a lise celular mecânica.
Para realizar a lise celular mecânica, ressuspenda os pellets em cinco mililitros de tampão A e transfira as células ressuspensas para tubos de centrífuga de 15 mililitros com 3,5 gramas de esferas de sílica. Insira os tubos em um instrumento mecânico de lise celular e execute um ciclo de 40 segundos a quatro metros por segundo. Centrifugue os tubos a 2.900 vezes G por 15 minutos, depois recupere o sobrenadante e mantenha-o no gelo.
Certifique-se de que o sobrenadante esteja limpo, repetindo a centrifugação se não estiver.