Isolamento de RNA alvo bacteriano ligado a RNA regulatório pequeno usando purificação de afinidade

Pegue um lisado de células bacterianas contendo componentes celulares, incluindo sRNA marcado com MS2 ligado ao seu RNA alvo.

O sRNA marcado com MS2 é um pequeno RNA regulador projetado que carrega uma alça de haste aptâmero MS2 em sua extremidade 5 ', que exibe alta afinidade pela proteína do revestimento viral MS2.

Transferir o lisado bacteriano para uma coluna de cromatografia de afinidade pré-equilibrada contendo resina de amilose ligada a proteínas de fusão compostas por proteína de ligação à maltose (MBP) e a proteína de revestimento MS2.

A proteína de revestimento MS2 imobilizada captura especificamente a alça do caule do aptâmero do sRNA marcado com MS2, retendo o sRNA ligado ao RNA alvo intacto.

Moléculas não marcadas que permanecem não ligadas são coletadas no fluxo.

Lave a coluna com tampão para remover as moléculas residuais não ligadas.

Eluir com um tampão contendo maltose, que desloca o MBP da resina, liberando o sRNA marcado com MS2 ligado ao seu RNA alvo.

Colete e armazene as frações no gelo para preservar a integridade do RNA para análise a jusante.

Remova a ponta da coluna, coloque uma coluna de cromatografia em um suporte de coluna e lave a coluna com água ultrapura. Adicione 300 microlitros de resina amilose e lave a coluna com 10 mililitros de tampão A. Dilua 1.200 picamoles da proteína MBP-MS2 em seis mililitros de tampão A e carregue-o na coluna.

Lave a coluna com 10 mililitros de tampão A.Em seguida, execute a purificação por afinidade MS2. Carregar o lisado celular na coluna e recolher a fracção de fluxo contínuo num tubo de recolha limpo. Lavar a coluna três vezes com 10 mililitros de tampão A e recolher a fracção de lavagem, em seguida, eluir a coluna com um mililitro de tampão E e recolher a fracção de eluição num microtubo de dois mililitros.

Mantenha todas as frações coletadas no gelo até a extração do RNA.