Um método de microdiluição em caldo para teste de suscetibilidade a antibióticos de bactérias Gram-positivas

Isole as colônias bacterianas Gram-positivas de uma placa de cultura e suspenda-as em um meio.

Diluir a suspensão para atingir a concentração bacteriana ideal para o ensaio.

Inocular os alvéolos de ensaio de uma microplaca contendo concentrações crescentes de um antibiótico lipoglicopeptídico e de um alvéolo de controlo do crescimento contendo apenas o meio.

Espalhe uma alíquota do poço de controlo nas placas de cultura para verificar a pureza da cultura e a contagem bacteriana.

Incubar para permitir o crescimento bacteriano, durante o qual a parede celular é sintetizada.

O antibiótico se liga ao peptidoglicano, um componente da parede celular, e seus precursores, inibindo a polimerização e enfraquecendo a parede.

A interrupção permite que a pressão osmótica cause lise celular.

Após a incubação, confirme a pureza da cultura e a contagem bacteriana ideal.

Inspecione os poços quanto ao crescimento bacteriano.

O poço de controle mostra crescimento visível, enquanto o poço de teste com a menor concentração de antibiótico que inibe completamente o crescimento indica a concentração inibitória mínima (CIM).

Nesta demonstração, uma placa recém-preparada será inoculada. Para preparar o inóculo, selecione várias colônias bem isoladas de um ágar sangue de 18 a 24 horas ou outra placa de ágar não seletivo. Aqui, são utilizadas cepas de S. aureus e E. faecalis de controle de qualidade.

Toque o topo de cada colônia com um cotonete estéril e transfira parte dele para um tubo contendo de um a cinco mililitros de CAMHB ou solução salina. Continue transferindo até que a turbidez corresponda a um padrão de McFarland de 0,5 dentro de 15 a 30 minutos após a preparação, dilua o inóculo de um a 100 em CAMHB para chegar a uma concentração final de cinco vezes 10 elevado ao quinto UFC por mililitro. O intervalo aceitável é de duas a oito vezes 10 elevado à quinta UFC por mililitro.

Imediatamente, usando uma pipeta multicanal com pontas estéreis, transfira 50 microlitros do inóculo final para cada poço apropriado da placa do painel MIC. Aqui, quatro fileiras são inoculadas com cada um dos dois isolados para um total de quatro repetições por isolado. Em seguida, para realizar uma verificação de pureza, use uma pipeta para transferir de um a 10 microlitros da solução no controle positivo de crescimento para um ágar não seletivo, como o ágar tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha.

Use um laço estéril para espalhar a solução sobre a superfície da placa. Gire a placa 90 graus e risque novamente para garantir que o inóculo seja distribuído uniformemente. Cubra o prato e reserve.

Em preparação para uma contagem de colônias, use uma pipeta de canal único para transferir 10 microlitros da solução no poço de controle de crescimento para 10 mililitros de mistura salina e, em seguida, transfira 100 microlitros para um meio de ágar não seletivo adequado, como ágar tripticase de soja com 5% de sangue de carneiro usando uma alça estéril, espalhe a solução por toda a superfície do ágar. Repita este processo duas vezes em direções diferentes para garantir uma distribuição uniforme do inóculo. Em seguida, empilhe até quatro painéis MIC em um recipiente de plástico, garantindo que o painel superior esteja hermeticamente fechado com uma tampa.

Em seguida, coloque uma toalha de papel úmida dentro do recipiente de plástico e feche-o firmemente com a tampa dentro de 30 minutos após a inoculação. Incube os painéis MIC, a placa de contagem de colônias e a placa de verificação de pureza em uma incubadora de ar ambiente a 35 graus Celsius para mais ou para menos por 16 a 20 horas. No dia seguinte, leia a concentração inibitória mínima como a concentração mais baixa que inibe completamente o crescimento bacteriano nos poços, conforme detectado a olho nu.

Determine o número de colônias na placa de contagem de colônias. Multiplique o número contado pelo fator de diluição. Por exemplo, 50 colônias vezes um fator de diluição de 10.000 é igual a cinco vezes 10 elevado à quinta UFC por mililitro.

Um intervalo aceitável é de 20 a 80 colônias, o que equivale a duas a oito vezes 10 elevado à quinta colônia formando unidades por ml. A concentração do inóculo é uma variável importante para controlar o teste de suscetibilidade, a fim de obter resultados precisos. Por fim, verifique a placa de pureza.

Se todas as colônias forem semelhantes às colônias usadas como inóculo, então ele pode ser considerado puro. Se houver outras colônias presentes, há potencial para a presença de um contaminante no painel MIC e o teste deve ser repetido.