JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:58 min • August 29th, 2025
Pegue uma lâmina com câmara contendo células epiteliais humanas com endossomos marcados com fluorescência.
Introduza bactérias patogênicas intracelulares e incube, permitindo que elas adiram às células.
As bactérias injetam proteínas que reorganizam o citoesqueleto do hospedeiro, formando saliências de membrana que internalizam as bactérias em vacúolos.
Esses vacúolos estendem projeções tubulares conectando-se ao sistema endolisossomal, uma rede de vesículas e organelas que regulam o tráfego intracelular.
Essas projeções redirecionam o transporte da vesícula e remodelam o sistema endolisossomal.
Lave para remover bactérias extracelulares e, em seguida, incube com um meio contendo antibióticos para eliminar quaisquer bactérias restantes.
Substitua por um meio de imagem sem soro contendo o antibiótico e adicione nanopartículas marcadas com um fluoróforo contrastante.
Incubar para permitir a entrada de nanopartículas via endocitose e acúmulo nas vesículas remodeladas.
Lave para remover nanopartículas não internalizadas e, em seguida, incube em um meio de imagem suplementado com soro.
As nanopartículas fluorescentes e os endossomos marcados permitem a visualização da remodelação endolisossomal induzida por bactérias.
Para iniciar este procedimento, meça o OD 600 das bactérias subcultivadas e dilua para um OD 600 de 0,2 em um mililitro de PBS, adicione quantidades apropriadas de bactérias às células HeLa na lâmina da câmara de 8 poços para obter uma multiplicidade de infecção de 100. Incubar por 30 minutos na incubadora de células.
Lave as células HeLa três vezes com PBS para remover bactérias não internalizadas. Este ponto de tempo é definido como zero hora pós-infecção ou zero hora p.i. Adicione 300 microlitros de meio de cultura fresco contendo 100 microgramas por mililitro de gentamicina às células e mantenha por uma hora.
Após uma hora, substitua o meio por um meio de imagem contendo 10 microgramas por mililitro de gentamicina. Adicione NPs de ouro-BSA-rodamina às células HeLa para obter uma concentração final de OD 520 de 0,1.
Incubar por uma hora. Após uma hora, remova o meio e lave três vezes com PBS. Finalmente, adicione 300 microlitros de meio de imagem fresco contendo 10% de FCS e 10 microgramas por mililitro de gentamicina pelo resto do tempo de incubação.