Cultivo de Mycobacterium tuberculosis em condições limitadas por ferro

Comece com uma placa de ágar contendo colônias de Mycobacterium tuberculosis cultivadas em um meio enriquecido com nutrientes.

Inocule uma única colônia em um caldo suplementado com nutrientes e incube com agitação para um crescimento uniforme.

Permitir que a cultura atinja a fase logarítmica tardia, onde as células são metabolicamente ativas.

Pipete um pequeno volume em uma placa de ágar enriquecida, espalhe-a uniformemente e incube até formar uma camada bacteriana contínua.

Umedeça um cotonete estéril com um meio mínimo de baixo teor de ferro (LIMM) e colete as bactérias.

Suspenda-os em um recipiente plástico contendo LIMM para evitar a contaminação por ferro.

Adicione um agente dispersante para evitar aglomeração e incube sem agitar.

Sob condições limitantes de ferro, as bactérias ativam respostas ao estresse e produzem sideróforos no citoplasma.

Estes são empacotados em vesículas extracelulares e liberados no ambiente.

Os sideróforos capturam o ferro e ajudam as bactérias a sobreviver.

Este sistema destaca a adaptação e sobrevivência micobacteriana em condições limitadas ao ferro

Inocular uma única colônia de MTB em dois mililitros de meio de caldo micobacteriano suplementado com enriquecimento de ADN. Incubar com agitação a 37 graus Celsius. Quando houver crescimento visível, extraia dois mililitros da cultura e meça o OD 540 em um espectrofotômetro.

Pare a incubação quando o OD 540 atingir 0,8, o que indica a fase logarítmica tardia. Espalhe 200 microlitros da cultura logarítmica tardia nas placas de ágar micobacteriano suplementadas com 0,2 glicerol, 0,5% de Tween 80 e ADN. Inocular pelo menos cinco placas.

Incube as placas a 37 graus Celsius. E após uma semana, o crescimento bacteriano é visível como uma camada confluente. Em seguida, molhe um cotonete estéril em um meio mínimo de ferro baixo.

Use este cotonete para coletar bactérias das placas de ágar. Inocule a bactéria em 100 mililitros de meio mínimo de baixo teor de ferro em um tubo. Colete bactérias suficientes para preparar uma suspensão com um OD 540 de um.

Dilua a suspensão 10 vezes para um litro com baixo teor de ferro mínimo médio e divida-a em duas garrafas plásticas estéreis. Em seguida, transfira dois mililitros da cultura para um tubo de cultura de cinco mililitros. Adicione 10 microlitros de 10% volume por volume de tiloxapol.

Incubar as culturas a 37 graus Celsius por 14 dias.