Isolamento de vesículas extracelulares contendo sideróforo de Mycobacterium tuberculosis

Pegue uma cultura de Mycobacterium tuberculosis cultivada em um meio limitante de ferro para aumentar a secreção de vesículas extracelulares contendo sideróforos, um quelante de ferro.

Centrifugue para peletar as bactérias.

Colete o sobrenadante e filtre-o para remover as bactérias residuais.

Transfira o filtrado para um sistema de ultrafiltração agitado e filtre para remover o excesso de meio e concentrar os EVs.

Centrifugue o concentrado em sedimentar os detritos celulares.

Transfira o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga e centrifugue para coletar o pellet EV.

Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um tampão e misture-o com um meio de gradiente de densidade concentrado para formar a camada inferior.

Sobreponha com concentrações decrescentes do meio gradiente para criar um gradiente de densidade descontínuo.

Adicione tampão na parte superior e centrifugue. Os EVs migram para a camada que corresponde à sua densidade flutuante.

Colete cada fração em um tubo separado.

A fração purificada com EVs contendo sideróforo está pronta para estudos a jusante.

Transfira a cultura para cinco tubos de centrífuga cônicos de 225 mililitros e centrifugue a 2.850 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Colete o sobrenadante da cultura com uma pipeta de 50 mililitros e esterilize-o com um filtro de 0,22 mícron.

Para isolar MEVs, transfira o filtrado de cultura para um sistema de ultrafiltração de células agitadas colocado a quatro graus Celsius e filtre o concentrado a uma pressão inferior a 50 PSI através de uma membrana de corte de 100 kilodaltons. Em seguida, centrifugue o filtrado de cultura concentrado a 15.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante em tubos de ultracentrifugação de policarbonato. Centrifugue o sobrenadante a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.

Depois disso, remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos membranosos em um total de um mililitro de PBS estéril por pipetagem suave. Misture 0,5 mililitros da suspensão de pellets com 1,5 mililitros de solução de iodixanol a 60% no fundo de um tubo de ultracentrífuga de polipropileno de parede fina. Sobreponha esta suspensão de iodixanol MEV 45% com um mililitro de soluções de iodixanol a 40%, 35%, 30%, 25% e 20% e um mililitro de PBS na parte superior.

Centrifugue a 100.000 vezes g por 18 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma seringa de Hamilton de um mililitro para coletar as frações de gradiente de densidade de um mililitro começando do topo. Dilua cada fração coletada para 20 mililitros com PBS e centrifugue a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.

Remova o sobrenadante e ressuspenda em 0,5 mililitros de PBS.