$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Pegue uma cromatografia de exclusão de tamanho ou coluna SEC repleta de esferas de resina porosa de tamanho definido. Ele contém um reservatório de amostra no topo.
Adicione solução salina tamponada com fosfato ou PBS para equilibrar as esferas da coluna e descarte o fluxo.
Carregue um filtrado de cultura bacteriana concentrado que contenha vesículas extracelulares ou EVs, proteínas secretadas e contaminantes.
EVs são nanovesículas à base de lipídios que carregam moléculas bioativas e são secretadas por bactérias.
Assim que o filtrado entrar nas contas, adicione PBS para conduzi-lo através do leito de resina.
Rejeitar o eluído inicial que contém grandes contaminantes não vesiculares.
Coloque um tubo de coleta sob a saída e adicione PBS sequencialmente.
Os EVs de grande porte evitam os poros menores da resina, movem-se pelos espaços interpartículas entre os grânulos e eluem primeiro.
Proteínas menores e contaminantes entram nos poros, seguem caminhos mais longos e eluem mais tarde.
Colete as frações de eluição precoce contendo EVs e armazene-as para análise.
Para o isolamento dos EVs, realize a cromatografia de exclusão de tamanho, ou SEC, usando uma pequena coluna com um volume de leito de 10 mililitros para menos de 100 mililitros de material de partida e uma coluna maior com um volume de leito de 47 mililitros para mais de 100 mililitros de material de partida. Durante várias horas antes do experimento, leve a coluna SEC e PBS à temperatura ambiente, seguida pela estabilização da coluna na posição vertical usando um suporte e suporte de laboratório padrão. Antes de conectar à coluna SEC, hidrate o reservatório de amostra, permitindo que cinco mililitros de PBS fluam através da frita para um recipiente de resíduos.
Em seguida, desparafuse a tampa de entrada da coluna para adicionar dois mililitros de PBS ao reservatório de amostra e conecte cuidadosamente o reservatório à coluna enquanto o PBS está pingando pela frita. Para equilibrar a coluna, adicione 47 mililitros de PBS ao reservatório de amostra, seguido de destampar a parte inferior da coluna SEC. Em seguida, permita que todo o buffer de amostra carregado flua pela coluna e descarte o fluxo.
Depois de carregar dois mililitros da amostra no reservatório da amostra, deixe a amostra entrar completamente na coluna e colete o fluxo. Adicione imediatamente PBS ao reservatório de amostra em um volume de 14,25 mililitros menos o volume da amostra para permitir que a solução flua através da coluna, descartando a quantidade igual ao volume vazio da coluna. Em seguida, posicione um microtubo de baixa ligação de dois mililitros diretamente abaixo da coluna SEC para coletar o primeiro fluxo ou fração um depois de permitir que dois mililitros de PBS passem pela coluna.
Continue a adicionar dois mililitros de PBS ao reservatório de amostra para coletar cada fração subsequente. Armazene as frações coletadas a quatro graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo.