Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:05 min. • September 26th, 2025
Comece com poços contendo células T CD4 + expressando receptores específicos para o peptídeo de ovoalbumina ou OVAp.
No poço de controle negativo, coloque uma inserção de membrana porosa.
Em um tubo, pegue células dendríticas infectadas com bactérias e carregadas com OVAp para apresentação na superfície.
Adicione células dendríticas diretamente no poço de teste e na inserção no poço de controle negativo.
Adicione meios aos poços e incuba.
No poço de teste, as células interagem para formar uma sinapse imunológica, facilitando a transferência bacteriana da célula dendrítica para a célula T, um processo conhecido como transinfecção.
No poço de controle negativo, a barreira de membrana impede a interação célula-célula, inibindo assim a transinfecção.
Adicione o antibiótico gentamicina aos poços e incuba.
A gentamicina não pode penetrar nas células eucarióticas, matando apenas bactérias não internalizadas, enquanto as bactérias internalizadas sobrevivem.
A amostra de teste contendo células T infectadas e a amostra de controle com células T não infectadas estão agora prontas para isolamento de células T e quantificação de transinfecção.
Em uma placa de cultura de 24 poços, adicione dois milhões de células T CD4 + em um volume de 0,5 mililitros a cada um dos cinco poços.
Em seguida, para controlar o contato físico, coloque barreiras de policarbonato com um tamanho de poro de três micrômetros no terceiro e quarto poços. Ao primeiro poço, adicione 0,1 mililitros das células dendríticas sobrecarregadas infectadas. Ao segundo poço, adicione 0,1 mililitros das células dendríticas infectadas não carregadas.
Adicione 0,1 mililitros das células dendríticas sobrecarregadas infectadas a um poço e 0,1 mililitros das células dendríticas não carregadas infectadas no outro poço. Finalmente, como controle negativo, infecte diretamente o quinto poço de células T CD4 + em um MOI de 10. Em seguida, aumente o volume total do poço para 0,6 mililitros com RPMI.
Incube a placa por 30 minutos para permitir a formação de sinapses imunológicas. Após a incubação, adicione 100 microgramas de gentamicina por mililitro de meio a cada poço e incube por uma hora. A gentamicina é um antibiótico aminoglicosídeo que não é capaz de penetrar nas células eucarióticas.
Portanto, nesta etapa, o aminoglicosídeo matará as bactérias extracelulares, mas não as bactérias intracelulares.