Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:20 min. • September 26th, 2025
Coloque uma lâmina de canal revestida de gelatina, conectada a uma bomba microfluídica, em um microscópio stage.
A lâmina contém células endoteliais humanas primárias cultivadas sob meio fluido, com cadeias de fator de von Willebrand ou VWF, uma glicoproteína, na superfície da célula.
Essas cordas são geradas estimulando as células com histamina.
O fluxo de meio controlado, aplicado através da bomba microfluídica, promove a secreção e o desenrolamento do FVW. Isso expõe domínios de associação específicos nas cadeias de caracteres VWF.
Pare o fluxo de meio, adicione um anticorpo específico para FVW conjugado com fluoróforo verde e retome o fluxo para rotular as cadeias com o anticorpo.
Pause o fluxo de mídia e introduza bactérias pneumococos vermelhas que expressam proteínas fluorescentes.
Reinicie o fluxo para distribuir as bactérias, permitindo a fixação aos domínios expostos por meio de adesinas superficiais.
Usando microscopia de fluorescência, visualize a ligação bacteriana em tempo real às cordas.
Pare o fluxo de mídia e adquira imagens de pilha Z para quantificar a ligação bacteriana às células endoteliais.
Para visualização microscópica, coloque a unidade fluídica na câmara de aquecimento de 37 graus Celsius. Coloque a lâmina do canal no palco de um microscópio pré-aquecido.
Controlar a morfologia celular e a integridade da camada HUVEC antes da injeção de histamina e bactérias na circulação do fluxo. Mantenha a configuração de fluxo. Induzir a liberação de FVW de corpos de Palade viáveis endoteliais injetando 136 microlitros de uma solução estoque de histamina 100 milimolares através de uma porta de injeção no meio ECGMS circulando no tubo de perfusão.
Para detecção de imunofluorescência de cadeias de FVW multimerizadas, injete 20 microgramas de um anticorpo conjugado FITC específico para FVW em um volume de 200 microlitros de PBS nos 13,6 mililitros circulantes de meio ECGMS. Para quantificar a ligação pneumocócica às cadeias de FVW geradas nas superfícies das células HUVEC, injete 1,35 vezes 10 na oitava UFC por mililitro de RFP expressando pneumococos em um volume máximo de um mililitro no meio ECGMS usando a porta de injeção. Selecione uma objetiva de imersão em óleo 63 vezes para ampliação do microscópio e ajuste as configurações do filtro de fluorescência no software do microscópio para o canal RFP com um filtro de detecção de 540 nanômetros para detecção de pneumococos que expressam RFP.
Para quantificação da ligação bacteriana às cadeias de FVW, crie instantâneos de pilhas Z de pelo menos 30 visualizações de campo representativas, cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intactos e conte a quantidade de pneumococos.