Imagem de fluorescência de infecção bacteriana associada a biomateriais em embriões de peixe-zebra

Comece com embriões de peixe-zebra anestesiados injetados com bactérias patogênicas marcadas com fluorescência, isoladamente ou misturadas com microesferas de biomaterial, para modelar a infecção associada ao biomaterial in vivo.

Colocar uma placa de Petri contendo meios basais com anestésico no palco de um microscópio de fluorescência estéreo equipado com filtros apropriados.

Adicione solução de metilcelulose ao prato para criar um meio viscoso que imobiliza os embriões para imagem.

Transfira embriões individuais para a metilcelulose e alinhe-os horizontalmente, garantindo que o local da injeção seja visível.

Usando o filtro de campo claro, concentre-se no local da injeção para atingir a região infectada.

Defina os parâmetros de imagem da pilha Z e adquira imagens de fluorescência em diferentes profundidades para capturar a dinâmica da infecção em três dimensões.

Usando um software, analise as imagens capturadas ao longo do tempo para quantificar a intensidade da fluorescência e monitorar a distribuição bacteriana.

Este protocolo permite uma comparação direta da progressão da infecção em embriões vivos com e sem exposição ao biomaterial.

Coloque uma placa de Petri de 100 milímetros contendo meio E3 suplementado com 0,02% de tricaína em um estágio de microscópio de fluorescência estéreo e adicione 500 microlitros de metilcelulose a 2% na placa de Petri. Para monitorar o progresso da infecção por microscopia de fluorescência, equipar os filtros de campo claro e fluorescente apropriados, alinhar os embriões infectados anestesiados horizontalmente em um ponto de metilcelulose em uma placa de Petri.

Use o filtro de campo claro para focar o tecido injetado danificado em uma ampliação de 160x. Defina a profundidade da pilha Z em 10 micrômetros e o tamanho do passo em cinco micrômetros para permitir a gravação de três imagens consecutivas. Em seguida, imagine os embriões individuais em configurações otimizadas idênticas com uma ampliação de 160x.

Use o plug-in ObjectJ no ImageJ para analisar as imagens.