JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:12 min • September 26th, 2025
Comece com um prato contendo uma câmara de agarose moldada com ranhuras.
Cada sulco contém embriões de peixe-zebra anestesiados submersos em um meio embrionário suplementado com um agente anestésico.
Sob um microscópio óptico, insira uma agulha de microinjeção no tecido muscular.
Injete uma suspensão contendo S. aureus e microesferas de poliestireno para modelar uma infecção associada ao implante.
Transfira os embriões injetados para poços individuais de uma placa de vários poços preenchida com um meio fresco e incuba.
As microesferas oferecem uma superfície física que suporta a colonização bacteriana e promove a infecção.
Para avaliar a infecção bacteriana associada ao implante, transfira cada embrião para um tubo separado e lave-o com um tampão. Adicione tampão e contas de cerâmica.
Homogeneizar para lisar os embriões e liberar conteúdo interno, incluindo bactérias.
Coloque os homogeneizados diluídos em placas e incube para permitir a formação de colônias.
Os embriões injetados com a suspensão microesfera-bactéria apresentam contagens de colônias mais altas do que aqueles injetados apenas com a suspensão bacteriana. Isso indica que as microesferas aumentam a suscetibilidade à infecção.
Depois de esperar cinco minutos para que os embriões sejam anestesiados, alinhe os embriões dentro das ranhuras em uma única orientação para a injeção. Defina o microinjetor para as configurações de injeção apropriadas e insira a agulha no tecido muscular do primeiro embrião em um ângulo de 45 a 60 graus sob um microscópio estéreo.
Mova suavemente a agulha para frente e para trás para ajustar a posição dentro do tecido conforme necessário e use o pedal do microinjetor para injetar a suspensão carregada. Ao injetar uma suspensão de microesferas de bactérias no tecido de embriões de peixe-zebra, a agulha deve ser inserida suavemente, mas com a mão firme. Após uma inserção bem-sucedida, um espaço deve ser criado para os materiais antes da injeção.
E manter os embriões em meio E3 sem tricaína em poços individuais de placas de 48 poços com trocas diárias de meio. Para monitorar a progressão da infecção por quantificação de unidades formadoras de colônias, transfira aleatoriamente cinco a seis embriões infectados viáveis para microtubos individuais de dois mililitros logo após a injeção e lave suavemente os embriões com PBS estéril. Depois de descartar as lavagens, adicione 100 microlitros de PBS estéril a cada tubo, seguido por duas a três esferas de zircônia estéreis de dois milímetros de diâmetro.
Em seguida, esmague os embriões em um homogeneizador a 3.500 rpm por 30 segundos e cultive o homogeneizado conforme demonstrado.