JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:48 min • September 26th, 2025
Pegue uma cubeta contendo uma solução de trabalho de tioflavina T, um corante fluorescente específico para amilóide, dissolvido em solução salina tamponada com fosfato.
Colocar a cubeta num espectrofluorómetro e registar o sinal de fluorescência da linha de base.
Pause a varredura e remova a cubeta.
Adicione o sobrenadante de cultura esterilizado por filtro coletado de células endoteliais pulmonares infectadas com bactérias virulentas Pseudomonas .
O sobrenadante contém agregados amilóides, que são proteínas ricas em folhas beta mal dobradas.
Misture suavemente o conteúdo por inversão para garantir uma distribuição uniforme.
Recarregue a cubeta no espectrofluorômetro e retome a varredura para adquirir um sinal de fluorescência baseado no tempo.
A tioflavina T liga-se especificamente a amiloides ricos em folhas beta, o que leva a uma fluorescência aumentada.
Execute uma varredura de fluorescência usando as mesmas configurações.
Um aumento na fluorescência em relação à linha de base indica a presença e a abundância relativa de amiloides induzidos por infecção no sobrenadante da cultura.
Para quantificar os amilóides dentro do sobrenadante, adicione 20 microlitros de solução estoque de tioflavina T 50X recém-preparada e filtrada a um mililitro de PBS em uma cubeta de espectrofotômetro de um mililitro e carregue a amostra diluída em um espectrofluorômetro.
Meça a emissão de fluorescência de linha de base usando uma excitação de 425 nanômetros. Varredura da emissão de fluorescência de 450 a 575 nanômetros em incrementos de dois nanômetros. Em seguida, configure o instrumento para realizar uma varredura de lapso de tempo usando uma excitação de 425 nanômetros e emissão de 482 nanômetros com aquisição de dados a cada 0,2 segundos por 60 segundos.
Pause a varredura após 20 segundos e adicione 10 microlitros de sobrenadante esterilizado por filtro à cubeta. Depois de misturar por inversão, recarregue a cubeta no espectrofluorômetro e retome a varredura baseada no tempo pelos 40 segundos finais. Após a conclusão do lapso de tempo, execute uma varredura final do espectro de emissões de fluorescência usando as configurações de varredura originais.