Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:27 min. • September 26th, 2025
Comece com uma cultura de Pseudomonas aeruginosa recombinante em um meio de seleção de antibióticos.
Essas bactérias abrigam um plasmídeo não replicativo integrado ao genoma próximo ao gene alvo bacteriano destinado à deletação.
A integração ocorreu por meio de sequências homólogas compartilhadas entre o plasmídeo e o genoma, resultando em uma única recombinação cruzada.
O plasmídeo codifica um gene de resistência a antibióticos e o gene sacB , que confere sensibilidade à sacarose.
Listre as bactérias em um meio contendo sacarose, mas sem o antibiótico e incuba.
Sem pressão antibiótica, ocorre uma segunda recombinação, ou um cruzamento duplo, entre regiões homólogas, extirpando o plasmídeo e o gene alvo.
Durante a multiplicação bacteriana, o plasmídeo excisado não é transmitido, tornando a bactéria tolerante à sacarose.
Colocar as bactérias num meio não selectivo e num meio que contenha sacarose ou antibiótico e incubar.
O crescimento nos meios não seletivos e de sacarose, mas não no meio antibiótico, confirma um cruzamento duplo bem-sucedido.
Comece cultivando colônias recombinantes cruzadas únicas em Pseudomonas Isolation Broth, ou PIB. Inocule e listre 10 microlitros de cada cultura em placas PIA pré-aquecidas, suplementadas com 10% de sacarose. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, remova as placas da incubadora e inspecione-as quanto ao crescimento. A colônia resistente à sacarose deve ser recombinante cruzada dupla. Use palitos de dente estéreis para remendar pelo menos 20 colônias em placas pré-aquecidas de PIA, PIA suplementado com 10% de sacarose e PIA suplementado com carbenicilina.
Incube as placas durante a noite e examine-as quanto ao crescimento no dia seguinte. Os verdadeiros recombinantes de cruzamento duplo serão sensíveis à carbenicilina e resistentes à sacarose.